En Tao Wang1, Julio Martínez Romero2, Isabel López Lara2

1Laboratorio de Microbiología Agrícola, Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, Instittuo Politécnico Nacional. 2Centro de Investigación sobre Fijación de Nitrógeno, Universidad Nacional Autónoma de México

La simbiosis rizobio-leguminosa

El nitrógeno es muy abundante en la atmósfera, sin embargo, las plantas no pueden utlizarlo en su forma elemental y tienen que obtenerlo del suelo principalmente en forma de nitratos o amonio. La fijación biológica de nitrógeno es un proceso clave en la biosfera, por el cual microorganismos portadores de la enzima nitrogenasa convierten el nitrógeno gaseoso en nitrógeno combinado. El grupo de bacterias al que se conoce colectivamente como rizobios, inducen en las raíces (o en el tallo) de las leguminosas la formación de estructuras especializadas, los nódulos, dentro de los cuales el nitrógeno gaseoso es reducido a amonio (Fig. 1). Se estima que este proceso contribuye entre el 60-80 % de la fijación biológica de nitrógeno. La simbiosis es inhibida si existe un exceso de nitrato o amonio en el suelo. En esta simbiosis en los nódulos, la planta huésped obtiene nutrientes nitrogenados de la bacteria (rizobios) y ofrece a ésta una fuente de carbono y un ambiente favorable para fijar nitrógeno. Esta simbiosis contribuye con una parte considerable del nitrógeno combinado en la tierra y permite a las plantas leguminosas crecer sin fertilizantes nitrogenados y sin empobrecer los suelos.

Las leguminosas muestran una amplia diversidad tanto morfológica como de hábitats y ecología, encontramos desde formas herbáceas anuales hasta árboles tropicales. Muchas leguminosas son noduladas por los rizobios. La fijación de nitrógeno en la simbiosis rizobio-leguminosa es de considerable importancia en agricultura, porque causa un aumento significativo del nitrógeno combinado en el suelo. Dado que la carencia de nitrógeno suele darse en suelos desnudos y sin abonar, las leguminosas noduladas ofrecen una ventaja selectiva en tales condiciones y pueden crecer bien en zonas donde no lo harían otras plantas. Es por ello que leguminosas arbustivas y arbóreas se emplean como plantas pioneras en la reforestación de zonas áridas y semiáridas. Por el interés que estas bacterias representan para la agricultura, empleándose como inoculantes (bio-fertilizantes) para los cultivos se han realizado investigaciones extensas sobre este sistema simbiótico, incluyendo estudios sobre la diversidad y la taxonomía de los rizobios. Rhizobium fue la primera bacteria producida a gran escala y se ha añadido como inoculante durante 105 años a diversos cultivos agrícolas, con éxito en muchos casos.

Por otro lado, el uso indiscriminado de fertilizantes nitrogenados en agricultura ha ocasionando graves problemas de contaminación. No todo el fertilizante que se aplica lo aprovecha la planta sino que en una cuantía importante acaba en lagos y lagunas. La fijación biológica de nitrógeno es la opción natural de fertilización química.

Taxonomía

Beijerinck en1888 obtuvo el primer cultivo bacteriano puro de un nódulo de raiz de leguminosa y lo llamó Bacillus radicicola. Posteriormente, Frank propuso el nombre Rhizobium para estos aislados. Basada en la especificidad de los huéspedes para 1929 ya se habían reconocido seis especies: R. leguminosarum, R. trifolii, R. phaseoli, R. meliloti, R. japonicum y R. lupini. En esta clasificación, cada especie se componía de cepas que compartían un grupo de leguminosas huésped. Trabajos posteriores desafiaron esta designación de especies basada en la especificidad del huésped. En 1944 Wilson reportó un gran número de nodulaciones que cruzaban las fronteras de las diferentes especies.En 1964 Graham y en 1968 Moffett y Golwell sugirieron revisar la taxonomía basándose en resultados de la taxonomía numérica. Más tarde, en 1974, Jordan y Allen dividieron estas especies en dos grupos de acuerdo con sus tasas de crecimiento, flagelos y reacciones ácido/alcalinas en medio YMA (Tabla 1). Además de estas seis especies, se incluyó un grupo misceláneo designado Rhizobium spp.

La taxonomía actual de los rizobios se basa en un enfoque polifásico que incluye morfología, bioquímica, fisiología, genética y filogenia. El uso del enfoque polifásico ha conferido a la taxonomía una base más natural y más confiable.

De acuerdo con la definición aceptada de especie en bacteriología, cada especie de rizobios consta de un grupo de cepas que comparten características que las distinguen como grupo de otros grupos de bacterias. El uso de técnicas moleculares ha provisto de una descripción más precisa para las especies. El análisis de secuencias de los genes 16S rRNA se ha convertido en uno de los principales criterios para la descripción de los géneros y las especies de rhizobios. Se considera que las cepas cuyas secuencias del gen 16S rRNA son similares en un 97% o más, probablemente pertenecen a la misma especie. Las relaciones filogenéticas inferidas del parecido de las secuencias de genes de 16S rRNA también constituyen la base principal para la descripción de los diferentes géneros de rhizobios; sin embargo, no hay un porcentaje definido para marcar las fronteras entre géneros. No obstante, cuando las secuencias de 16S rRNA son muy parecidas, no sirven para distinguir especies cercanamente relacionadas y esto ocurre debido a que este gen está muy conservado entre todos los organismos vivos. En la taxonomía de Rhizobium, la hibridación de ADN-ADN y otros métodos han sido incluidos para definir especies dentro de cada género.

Se requiere estimar el parecido entre secuencias de ADN-ADN, a partir de la hibridación ADN-ADN, para definir a las especies bacterianas. Esta técnica se basa en la característica de la doble hélice del ADN que puede desnaturalizarse en altas temperaturas y reasociarse en bajas temperaturas y es especialmente útil cuando las cepas comparten más del 97% de sus secuencias de genes 16S rRNA. La cantidad de ADN reasociado o la tasa de reasociación se relaciona con la homología de las secuencias de ADN. Se sugiere que cuando las diferencias entre dos secuencias de ADN sobrepasan el 30%, se cruza el borde que separa a dos especies. Cepas que comparten un parecido de ADN-ADN entre 25 y 60% pueden representar diferentes especies dentro del mismo género. Si el parecido es menor a 10% se considera que pertenencen a diferentes géneros. La mayor parte de las especies rhizobianas definidas cumplen con este criterio. Son excepciones a esta regla: S. fredii, R. tropici y M. plurifarium. En cada uno de estas tres especies se incluyen cepas o grupos que comparten menos de un 70% de parecido de ADN-ADN. En estos casos, es necesario incluir otros métodos como electroforesis (SDS-PAGE) de proteinas, electroforesis de multilocus enzimáticos (MLEE) y otros, para definir todas las especies descritas.

Hasta la fecha se han propuesto 6 géneros, que son: Allorhizobium, Azorhizobium, Bradyrhizobium, Mesorhizobium, Rhizobium y Sinorhizobium. Con base en las secuencias de genes de 16S rRNA, todos los rizobios definidos son miembros de la subdivisión a de las Proteobacterias. En esta misma subdivisión se encuentran bacterias del género Agrobacterium que forman tumores en plantas. Los 6 géneros de los rizobios son 6 grupos filogenéticos entremezclados con otros géneros de las α-Proteobacteria. En el árbol filogenético los géneros Azorhizobium y Bradyrhizobium son dos ramas separadas de los otros géneros de rhizobia. Los géneros Mesorhizobium y Sinorhizobium son dos grupos distintos pero relacionados con los géneros Allorhizobium y Rhizobium. El género Rhizobium está compuesto de dos subramas: (1) las especies R. galegae y R. huautlense junto con Allorhizobium y tres especies de Agrobacterium forman la primera subrama; (2) el resto de las especies, incluyendo la especie tipo R. leguminosarum, y Agrobacterium rhizogenes forman la otra subrama. Hay bacterias no-simbióticas cercanamente relacionadas con cada uno de los géneros de rizobios. Las relaciones entre las bacterias simbióticas y las no-simbióticas y el impacto que estas relaciones puedan tener sobre la taxonomía de rizobios, se discutirá más adelante.

En los casos de R. tropici, R. etli, R. huautlense y M. amorphae, se utilizó el análisis de enzimas metabólicas (MLEE) y la distancia genética (determinada a partir de la proporción de loci enzimaticos con diferente mobilidad en electroforesis) de 0.5 se consideró como uno de los criterios para definir a dichas especies. Valores de distancia genética menor que 0.5 se encuentran entre cepas dentro de una misma especie, por ejemplo en R. leguminosarum, y mayor que 0.5 entre diferentes especies dentro del género Mesorhizobium. El análisis MLEE provee información acerca de la variación genética en una especie, de tal información se puede estimar la estructura genética en poblaciones naturales para valorar el papel evolutivo de la selección Darwiniana, deriva aleatoria, mutación e intercambio horizontal de genes. Selander y colaboradores en 1986 resumieron los métodos de este análisis. Los rhizobia parecen tener una estructura de población clonal con escasa recombinación genética entre poblaciones distantes; sin embargo, hay datos que indican que existe transferencia genética entre poblaciones locales.

El análisis de proteinas totales en electroforesis en una dimensión permite agrupar a los rhizobia con base en las similaridades de los patrones. Los rhizobia se dividen en diferentes grupos y estos grupos pueden ser definidos como especies si incluyen una cepa de referencia para cada especie definida. Generalmente, los grupos definidos por electroforesis de proteinas están relacionados con aquellos que se pueden distinguir por parecido de ADN-ADN o por patrones de enzimas metabólicas.

Con la reacción de la polimerasa en cadena (PCR) se pueden generar patrones llamados Afingerprints@ de ADN (que literalmente quiere decir huellas digitales del ADN) que se usan para investigar la diversidad genética dentro de las poblaciones de rizobios. Estos métodos se basan en la variación genética en las secuencias blanco localizadas en los genomas que sirven para anclar a los cebadores y que muestran tamaños moleculares diferentes de los productos sintetizados por la reacción de PCR.

El ADN puede ser amplificado con cebadores dirigidos a diferentes secuencias; por ejemplo, cebadores sencillos para las secuencias ABOX@, cebadores al azar en los RAPD, o pares de cebadores para distintos tipos de secuencias como son secuencias repetidas extragénicas palindrómicas (REP), secuencias intergénicas repetidas enterobacterianas o secuencias consensos intergénicas repetidas de enterobacterias. Estos métodos son útiles para detectar la diversidad genética y para el agrupamiento de las cepas.

La determinación de polimorfismo en los tamaños de los fragmentos de restricción (RFLP) es otro método para revelar la diversidad genética entre grupos de cepas. Este análisis incluye la digestión del ADN total, la separación del ADN digerido por electroforesis y la hibridación de los patrones de restricción con un detector específico de un gen. También se pueden digerir productos sintetizados por PCR y analizar los RFLP directamente por electroforesis. Así se pueden caracterizar a los genes 16S rRNA amplificados por PCR o ADN del espacio intergenético (IGS).

En la descripción del fenotipo de las bacterias se reporta morfología, bioquímicas, fisiologías, los patrones de utilización de fuentes de carbono y nitrógeno, los patrones de resistencia a antibióticos, las características y otras. El cúmulo de estos datos se evalúan normalmente por un análisis de agrupamiento, la llamada taxonomía numérica. Las características fenotípicas pueden ofrecer una visión detallada de la variación de las bacterias dentro de una especie o entre diferentes especies. También permite reconocer rasgos característicos de cada especies.

La descripción del rango de huéspedes también se incluye en la deficinición taxonómica de estas bacterias. Algunos rizobios tienen un rango más amplio de plantas huéspedes que otras. Se ha reportado que B. japonicum es capaz de nodular un gran número de leguminosas nativas de las regiones tropicales, al igual que a la soya. Mientras que S. meliloti ha sido aislado principalmente de las plantas del género Medicago, Meliloti y Trigonella.

Hasta la fecha se han descrito 30 especies en 6 géneros. Todas ellas son bastones aeróbicos Gram-negativos. Las células tienen formas irregulares (curvas, en forma de X o de Y, llamadas bacteroides) dentro de los nódulos. Los bacteroides son las formas diferenciadas que fijan nitrógeno. Normalmente los bacteroides completamente desarrollados ya no pueden volver a reproducirse, aunque existe controversia al respecto. Se ha reportado que los rizobios tienen tres diferentes estados de vida: uno dentro de los nódulos de las leguminosas, otro en suelo y otro dentro de plantas no leguminosas como endófitos. Todos los rizobios pueden vivir muy bien como saprófitos en los suelos o en medios de cultivo. Algunos aislados pueden ser obtenidos independientes de plantas en suelos químicamente contaminados. Como endófitos, los rizobios han sido aislados de diferentes plantas. Por ejemplo, R. leguminosarum bv. trifolii se ha encontrado en raíces de arroz y R. etli en raíces de maiz. Pueden también introducirse y colonizar otras plantas, tales como sucede con Azorhizobium caulinodans en las raíces de la oleaginosa Brassica napus. Estas asociaciones entre rizobios y plantas no leguminosas puede mejorar el crecimiento de las plantas aunque no se ha demostrado que sea mediante la fijación de nitrógeno.

Hay algunas características distintivas entre los géneros de rizobios. El género Azorhizobium contiene cepas que forman nódulos de raíz y de tallo y fijan nitrógeno en condiciones de vida libre. Las cepas de Bradyrhizobium crecen lentamente (colonias de menos de 1 mm de diámetro después de 7 días de incubación) y producen álcali en medio YMA. El género Mesorhizobium incluye cepas con colonias de crecimiento lento o moderado (colonias de 1-2 mm después de 5 a 7 días de incubación) y produce ácido en medio YMA. Los géneros restantes, Allorhizobium, Rhizobium y Sinorhizobium crecen rápido (colonias > 2 mm después de 5 a 7 días de incubación) y producen ácido en medioYMA. A continuación se presentan las descripciones de los géneros definidos.

Género Allorhizobium. Este género contiene sólo una especie, A. undicola. Se trata de bacilos Gram negativos de 0.5-0.7 x 2.0-4.0 μm que forman colonias de 0.5-3.0 mm de diámetro después de 1-2 de incubación en YMA. A. undicola es un rizobio de rápido crecimiento que produce ácido y polisacáridos extracelulares en YMA. Fue aislado originalmente de los nódulos de la raiz de una planta acuática, Neptunia natans, que crece en Africa.También nodula Medicago sativa, Acacia seyal, Acacia tortilis, Lotus arabicus y Faidherbia albida. A. undicola forma una rama más cercana a las especies de Agrobacterium que a las especies de Rhizobium en el árbol filogenético obtenido a partir del análisis de las secuencias de genes de 16S rRNA.

Género Azorhizobium. Bacilos de 0.5-0.6 x 1.5-2.5 μm. Se mueve en medio sólido gracias a flagelos peritricales y en medio líquido con un flagelo lateral. Las colonias son circulares, translúcidas, gomosas y tienen un color cremoso. Crece tan rápido como Rhizobium (las colonias miden más de 2 mm de diámetro después de 2 días de incubación) pero produce álcali como Bradyrhizobium en YMA. Crece mejor con ácidos orgánicos como fuente de carbono que usando carbohidratos (excepto glucosa). Fija N₂ en condiciones microaeróbicas y crece bien en N₂ con vitaminas en un medio libre de nitrógeno. En condiciones de microaerobiosis se requiere ácido nicotínico para la fijación de N₂. Hay una sola especie descrita en este género, A. caulinodans. Esta bacteria fue aislada de nódulos de los tallos de Sesbania rostrata que crece en Senegal. También puede formar nódulos en la raíz de la planta huésped. S. rostrata es una de las pocas plantas leguminosas que nodulan en los tallos y tiene un gran potencial para ser utlizada como abono verde. La especie A. caulinodans tiene muchas características que la diferencían de otros grupos rizobiales. En el árbol filogenético de los rizobios forma una rama distantemente relacionada con los otros rizobios pero cercana a las especies de Xanthobacter (similaridad del 98.2% de las secuencias de los genes 16S rRNA). Por esta razón y considerando que sus características relacionadas con la fijación de nitrógeno en vida libre así como la organización de los genes nod y la forma de invadir al huésped, se piensa que tal vez Azorhizobium pudo haber evolucionado de una bacteria diazotrófica a una simbiótica adquiriendo genes nod por transferencia horizontal o tal vez Azorhizobium es una forma primitiva de rizobio. Se ha planteado la posibilidad, basada en los datos de sistemática molecular, de combinar Azorhizobium y Xanthobacter con Aquabacter. La habilidad de nodular los tallos de Sesbania y de fijar nitrógeno tanto en vida libre como en condiciones simbióticas son características únicas de esta especie. Esta bacteria invade las raíces de Sesbania entrando por grietas de las raíces laterales, que son fisuras epidérmicas normales que se forman alrededor de raíces laterales emergentes. Esta ruta de invasión es diferente a las de las otras bacterias que entran a las raíces a través de procesos de infección altamente especializados que involucra la presencia de hilos de infección. A. caulinodans has sido usada como bacteria promotora del crecimiento del arroz y se investigan los mecanismos que permiten su penetración en las raíces del arroz. No se conocen plásmidos simbióticos para este género y se estima que los genes simbióticos están localizados en el cromosoma.

Género Bradyrhizobium. Estas bacterias son bacilos de 0.5-0.9 x 1.2-3.0 μm. Se mueven con un flagelo polar o subpolar. Este género consiste de cepas de lento crecimiento, productoras de álcali. Las colonias son circulares, rara vez translúcidas, blancas y convexas con un diámetro menor a 1 mm entre 5 y 7 dias de incubación.. Las tres especies definidas en este género, B. japonicum (especie tipo), B. elkanii y B. liaoningense pueden nodular a la soya (Glycine max). B. japonicum tiene una amplia gama de plantas huéspedes, incluyendo muchas leguminosas tropicales y algunas de zonas templadas. Algunas especies fijan nitrógeno en vida libre bajo ciertas circunstancias. Algunos rizobios fotosintéticos formadores de nódulos de tallo aislados de la leguminosa acuática Aeschynomene han sido identificados como miembros de B. japonicum. B. elkanii se distingue de B. japonicum por diferencias en sus secuencias de ADN, en patrones de enzimas metabólicas de exopolisacáridos, en su contenido de ácidos grasos y hemoproteinas al igual que por diferencias en sus patrones de resistencia a antibióticos. El tiempo de generación de estas dos especies es de 8 horas o más. Las dos especies de tienen una relación filogenética cercana a Rhodopseudomonas palustris, Afinis spp. y Blastobacter denitrificans. Se desconoce la posición filogenética exacta de B. liaoningense porque no se dispone de una secuencia completa del gen 16S rRNA de esta especie. El análisis comparativo de la secuencia parcial del gene16S rRNA indica que B. liaoningense tiene una relación más cercana con B. japonicum que con B. elkanii. Las cepas de B. liaoningense crecen mucho más despacio (tiempo de generación entre 16-39 hr) que las cepas de B. japonicum y B. elkanii. Algunas características bioquímicas y diferentes patrones de utilización de carbohidratos permiten distinguir a B. liaoningense de las otras dos especies. Se han obtenido también aislados de Bradyrhizobium de otras leguminosas pero no se ha definido la especie a la que corresponden. De las especies identificadas, ninguna tiene plásmido simbiótico y los genes simbióticos están localizados en el cromosoma. Se ha reportado que existe sólo un operón del gen ribosomal en Bradyrhizobium.

Género Mesorhizobium (Tabla 2). Las bacterias de este género son bacilos que miden 0.41-0.9 x 1.2-3.0 μm. Generalmente son pleomórficas en condiciones adversas de crecimiento, tales como alta concentración de sales. Se han reportado flagelos peritricales o un flagelo polar o subpolar. Las colonias en YMA son circulares, convexas, semitranslúcidas y mucilaginosas; miden 2-4 mm de diámetro después de 5 días de incubación a 28°C para algunas especies o menos de 1mm después de 7 días para otras. Son bacterias quimio-organotróficas que utilizan una gran variedad de carbohidratos, ácidos orgánicos y aminoácidos como fuente de energía. No utilizan ni celulosa ni almidón. Todas las cepas producen ácido en YMA. Forman nódulos fijadores de nitrógeno en las raíces de diferentes plantas leguminosas de regiones templadas, subtropicales y tropicales. Se separó a este género de Rhizobium debido a su posición filogenética única, su crecimiento lento o moderado y su producción de ácido. Hay siete especies en este género: M. loti (especie tipo), M. amorphae, M. ciceri, M. huakuii, M. mediterraneum, M. plurifarium y M. tianshanense. La especie tipo, M. loti, fue transferida del género Rhizobium. Entre las siete especies definidas, M. amorphae y M. huakuii tienen plásmido simbióticos y el resto tiene los genes simbióticos en sus cromosomas. En la especie tipo, M. loti, se ha descubierto un fragmento de ADN transferible entre bacterias que contiene genes simbióticos al que se ha dado el nombre de isla simbiótica. Entre estas especies es común la existencia de dos operones ribosomales; sin embargo, en un aislado mexicano se observa una sola copia del gen 16S rRNA. Los huéspedes y los orígenes geográficos de estas especies se muestran en la Tabla 3. También hay bacterias no simbióticas cercanamente relacionadas con Mesorhizobium. Entre estas bacterias no simbióticas se encuentra una bacteria no cultivable Candidatus liberobacter, y otras que pertenecen a los géneros Aminobacter, Chelatobacter, Phyllobacterium y a grupos que aún no tienen nombres.

Género Rhizobium (Tabla 4). Son bacilos que miden 0.5-1.0x1.2-3.0 μm. Se mueven por medio de 1-6 flagelos que pueden ser peritricales o subpolares. Las colonias generalmente son blancas o color beige, circulares, convexas, semitranslúcidas u opacas y mucilaginosas; generalmente miden 2-4 mm de diámetro a los 3-5 días de incubación en YMA. El crecimiento en medio de carbohidratos generalmente está acompañado de reacción ácida y abundante cantidad de gelatina polisacárida extracelular. Son quimio-organotróficas, utilizando una gran variedad de carbohidratos y ácidos orgánicos. Algunas cepas requieren biotina, ácido nicotínico, pantotenato o tiamina como factores de crecimiento. Las cepas de este género son rizobios de rápido crecimiento productores de ácido en YMA. Hay nueve especies definidas: R. leguminosarum (especie tipo), R. etli, R. galegae, R. gallicum, R. giardinii, R. hainanense, R. huautlense, R. mongolense y R. tropici. Nodulan diferentes especies de leguminosas en zonas templadas o tropicales. Estas especies forman un grupo polifilético en el árbol filogenético. R. giardinii es una rama distantemente relacionada con las otras especies. R. galegae y R. huautlense tienen una relación más cercana con las especies de Agrobacterium que con las otras especies de Rhizobium. El resto de las especies y Agrobacterium rhizogenes forman un grupo. Estas especies tienen tres copias de los genes ribosomales y los plásmidos simbióticos son comunes en ellas. Sin embargo, el plásmido simbiótico (o parte de él, incluyendo genes simbióticos) puede integrarse en el cromosoma. Tambien se han aislado cepas de R. etli que carecen de genes simbióticos R. etli es importante en México, en particular, y en América Latina, en general, ya que esta especie predomina en los nódulos del frijol común. R. huautlense fue aislado en México y se ha demostrado que forma nódulos en suelos inundados. Se ha secuenciado completamente la secuencia del plásmido simbiótico de la cepa CFN42 y se empieza a trabajar para determinar la secuencia de todo el genoma. Debido a que las especies de Agrobacterium, Rhizobium, y Allorhizobium se entremezclan, además de que no se distinguen por características fenotípicas, se ha propuesto combinar los tres géneros en uno solo, lo cual ha sido causa de controversia.

Género Sinorhizobium (Tabla 5). Son bacilos que miden 0.5-1.0x1.2-3.0 μm. El nombre genérico Sinorhizobium fue propuesto por primera vez para designar a las bacterias de rápido crecimiento aisladas en China que nodulan a la soya. Posteriormente se separó este género de Rhizobium principalmente debido a las diferencias en las secuencias de genes 16S rRNA sin embargo no hay características fenotípicas específicas conocidas que distingan estos dos géneros. Las ocho especies dentro de este género crecen rápidamente y producen ácido en medio YMA. Se han identificado tres copias del gen ribosomal en ellas. Plásmidos grandes e incluso megaplásmidos son comunes en estas especies y en algunos casos los genes simbióticos están localizados en un megaplásmido. La especie tipo, S. meliloti fue transferida del género Rhizobium y ha sido estudiada extensamente. En esta especie son comunes dos megaplásmidos, megaplásmido 1 (plásmido Sym) y megaplásmido 2 (plásmido Exo), con respectivos pesos moleculares de 1700 y 1400 kbp. En varios laboratorios se obtuvo las secuencias completas del cromosoma y los megaplásmidos. Además de la especie tipo, otras especies de este género son: S. arboris, S. fredii, S. kostiense, S. medicae, S. saheli, S. terangae y S. xinjiangense. Las diferencias entre estas especies radican en el análisis filogenético de las secuencias de genes 16S rRNA, patrones de proteinas y enzimas, parecido entre secuencias de ADN, caracterización fenotípica y especificidad de huésped. Algunas características de estas especies se listan en la Tabla 6. Algunos grupos de rhizobia de suelo mexicano asociados a la leguminosa Leucaena leucocephala han sido clasificados como Sinorhizobium. Se ha secuenciado el plásmido simbiótico de una cepa de Sinorhizobium con un amplio espectro de huéspedes, NGR234, y se ha descubierto que tiene una estructura de mosaico parecida a algunas secuencias del plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens o a genes de otras bacterias. También se ha reportado que el plásmido simbiótico de NGR234 puede integrarse en un megaplásmido o dentro del cromosoma en condiciones de laboratorio. Un pariente cercano de Sinorhizobium es la bacteria Ensifer cuya secuencia del gen 16S rRNA se parece en un 98% .

La relación cercana entre especies de rizobios y algunas bacterias no-simbióticas indica que los rizobios pueden tener un origen común con otras bacterias. Se puede suponer que nuevos linajes de rhizobios siguen emergiendo en la naturaleza debido a la transferencia de los genes simbióticos y al hecho de que bacterias no-simbióticas, relacionadas con rizobios, pueden convertirse en bacteria formadoras de nódulos eficientes tanto en condiciones de laboratorio como de campo. Estos resultados indicarían que nuevos géneros y especies de rizobios pueden surgir.

Se necesitan criterios estándar para la taxonomía en el futuro. Estos nuevos estándares deben ofrecer una guía para la definición de nuevos géneros y especies. Los criterios utilizados en diferentes trabajos de investigación no son uniformes. Por ejemplo, para las primeras especies descritas se cuenta con información fenotípica acerca de su morfología celular, flagelos, requerimientos de factores de crecimiento, rango de pH y temperatura, tolerancia a NaCl, resistencia a antibióticos, entre otros datos. Estos datos normalmente no están completos en las especies descritas recientemente.

Por otra parte, la definición de géneros es un gran problema actualmente en taxonomía y las soluciones generalmente son más artificiales que naturales. Por una parte, la definición de género se basa principalmente en la filogenia del gen 16S rRNA y las diferencias fenotípicas han sido totalmente ignoradas en muchos casos, lo que ha llevado a decisiones conflictivas tales como en el caso de la separación de Sinorhizobium y Rhizobium o la sugerencia de combinar los géneros Agrobacterium y Rhizobium. Por otro lado, no existe un estándar filogenético oficial para definir género. Haukka y Young sugirieron que R. galegae (que incluye ahora a R. huautlense), A. tumefaciens- A. rubi y A. vitis deberían pertenecer a diferentes géneros ya que el parecido de sus secuencias de genes 16S rRNA es menor que un 90% y este umbral fue el nivel de separación aceptado para Sinorhizobium. Por la misma razón se ha sugerido el género Allorhizobium dentro de esta rama del árbol filogenético. Sin embargo, considerando tanto las relaciones filogenéticas como los rasgos fenotípicos, Kuykendall y colaboradores hicieron la sugerencia de combinar dentro un solo género todas las especies clasificadas en los géneros Rhizobium, Agrobacterium y Allorhizobium.

El proceso de nodulación

Se conocen bien las etapas de la infección y desarrollo de nódulos radicales (Animación 1). Estas incluyen:

1. Reconocimiento de la combinación adecuada de organismos, tanto por parte de la planta como de la bacteria, y adherencia de la bacteria a los pelos radicales.

2. Invasión del pelo radical y formación de un canal (o hilo) de infección

3. Desplazamiento de las bacterias hacia la raíz principal a través del canal de infección.

4. Diferenciación de las bacterias en un nuevo tipo al que se le llama bacteroides, dentro de las células de la planta, y desarrollo del estado de fijación de nitrógeno.

5. División de las células bacterianas y vegetales y formación del nódulo radical maduro.

A continuación se describen estas etapas en más detalle:

Las plantas leguminosas secretan compuestos específicos que atraen a los rizobios. Entre estos compuestos se encuentran flavonoides y en respuesta a ellos los rhizobios activan una serie de genes implicados en la nodulación. El primer paso en la formación de los nódulos es la adherencia de la bacteria a la planta. En la superficie del rizobio se localiza una proteína específica de la adherencia, la ricadesina. Es una proteína que se une al calcio y puede actuar captando complejos de calcio en la superficie de los pelos radicales. Otras sustancias, como las lectinas, que son proteínas que contienen carbohidratos, también cumplen una función en la adherencia planta-bacteria. Las lectinas han sido identificadas en los extremos de pelos radicales y en la superficie de las células de rizobio. Después de la unión, los pelos radicales se enroscan debido a la acción de sustancias específica secretadas por la bacteria, que se conocen como factores Nod (veáse mas adelante). Algunos pelos radicales se enroscan hasta 360 ° formando una estructura a la que se llama "cayado de pastor". La bacteria penetra entonces en el pelo radical e induce la formación, por parte de la planta, de un tubo de composición similar a la pared celular, conocido como canal de infección, que avanza por el pelo radical. A continuación, la infección alcanza a las células de la raíz adyacentes a los pelos radicales, y los factores Nod estimulan la división de las células vegetales, produciendo finalmente el nódulo. Las bacterias son liberadas desde el canal de infección al citoplasma de las células vegetales por un mecanismo similar al de endocitosis (Animación 2). Los rizobios quedan separados del citoplasma por una membrana derivada de la planta hospedadora y que se llama la membrana peribacteroidal (MPB). A continuación hay una división continua y sincronizada de los rizobios rodeados de MPBs. Al cesar la división las bacterias se transforman en unas formaciones ramificadas, hinchadas y deformes, llamadas bacteroides. Estos quedan rodeados, individualmente o en pequeños grupos por la MPB. A la estructura que contiene estos grupos de bacteroides rodeados por la MPB se les llama simbiosomas (Animación 2). Los bacteroides pueden llegar a ser hasta 40 veces más grandes que los bacilos a partir de los que se desarrollan, y hasta varios miles se encuentran en una sola célula vegetal. La fijación de nitrógeno no se inicia hasta que se han formado los bacteroides. El sistema vascular de la planta se extiende dentro del nódulo y transporta nutrientes hacia y desde el nódulo. Cuando el nódulo se deteriora las bacterias pasan al suelo. En algunos casos las formas bacteroidales no tienen capacidad de división, pero los nódulos contienen siempre algunos rizobios en estado de latencia. Estas formas proliferan en el suelo utilizando como nutrientes algunos de los productos del nódulo destruído y las bacterias pueden iniciar la infección en otras raíces o mantenerse en estado libre en el suelo.

Tipos de nódulos y especificidad de la interacción rizobio-leguminosa

Hay que recordar que la familia de las leguminosas es enorme y diversa y comprende alrededor de 20.000 especies. Dada esta diversidad, no es adecuado hacer generalizaciones, hay diferentes modos de infección (no siempre es a través de canales de infección) y las formas y modo de desarrollo de los nódulos pueden ser muy variadas. En general, los nódulos se pueden dividir en dos tipos: 1) nódulos indeterminados, que contienen un meristemo persistente resultando en formas cilindricas y a menudo ramificadas (como los nódulos de alfalfa mostrados en la Figura 2A), y 2) nódulos determinados que carecen de un meristemo persistente y tienen forma redondeada (como el nódulo de frijol mostrado en la Figura 2B).

La formación de una simbiosis efectiva es un proceso altamente específico, sin embargo, el grado de especificidad varía tremendamente entre los diferentes rizobios. Así algunas cepas tienen un rango de hospedador muy reducido como por ejemplo R. leguminosarum biovar trifolii que sólo fija nitrógeno en especies de Trifolium (trébol) o S. meliloti, que nodula especies de los géneros Medicago, Melilotus y Trigonella. Otras por el contrario muestran un amplio rango de hospedador, este es el caso de Rhizobium sp. NGR234 que nodula 112 géneros incluyendo la no-leguminosa Parasponia.

Bases moleculares de la interaccion rizobio-leguminosa

El aspecto de la especifidad en la relación rizobio-leguminosa ha promovido gran cantidad de estudios para identificar la señales implicadas. Se conocen las señales que se intercambian en la etapa temprana de la interacción (Fig. 3) mientras que para las etapas subsiguientes (infección, liberación de los bacteroides, comienzo de fijación de nitrógeno) se conocen algunos componentes de la bacterias que son necesarios pero no cómo actúan.

La primera señal implicada en la interacción la provee la planta. Los rizobios son capaces de notar la presencia de la raiz de la leguminosa por medio de moléculas de bajo peso molecular (flavonoides, isoflavonoides y betaínas) secretadas por la raíz. Este proceso tiene especificidad hasta cierto punto ya que las leguminosas secretan flavonoides específicos para atraer a rizobios específicos(Figs. 3 y 4; Tabla 7). En respuesta a la señal de la planta los rizobios responden sintetizando otras señales específicas, los factores Nod, dirigidos hacia la planta hospedadora(Figs. 3, 5a, 5b, 5c y5d). Los genes de la bacteria implicados en la síntesis de los factores Nod son los genes nod (nodulación). Estos genes, a excepción de nodD, no se expresan si no se encuentra la señal inductora adecuada de la planta. El gen nodD se expresa constitutivamente y la proteína NodD tiene la capacidad de reconocer los flavonoides específicos secretados por la planta. Los operones de los genes nod están precedidos por un promotor que contiene una secuencia consenso. A esta secuencia consenso se le llama caja de nodulación (o caja nod) y que es reconocida por la proteína NodD. Una vez activada por los flavonoides, la proteína NodD a su vez va a activar la transcripción de los genes de la nodulación mediante su unión a las cajas nod.

La estructura del factor Nod mayoritario de S. meliloti se determinó en 1990 (Fig. 5) y desde entonces las estructuras de los factores Nod de muchos otros rizobios se han determinado (Fig. 5 y Tablas 8 y 9). La información detallada de la estructura de los factores Nod y su biosíntesis se encuentra en varias revisiones. Todos los factores de nodulación caracterizados tienen una estructura básica común que consiste en un oligómero de N-acetil-D-glucosamina unidos por enlace β 1 —> 4 que lleva unido un ácido graso al nitrógeno del extremo no reductor. Debido a la semejanza estructural del oligosacárido a quitina, polímero β 1 —> 4 de glucosamina típico de hongos y del exoesqueleto de insectos, a los factores Nod también se les llama LCOs (del inglés: lipo-chitin oligosaccharides).

Las estructuras de los factores Nod producidos por los diferentes rizobios varían en: 1) la presencia de grupos adicionales mayormente en los extremos del oligosacárido de quitina, 2) en el tipo de ácido graso presente en el extremo no reductor, y 3) en la longitud del esqueleto de oligosaccharido (Fig. 5 y Tablas 8 y 9). Estas variaciones son los determinantes mayores de la especificidad de hospedador. Un ejemplo bien estudiado de modificación que determina el rango de hospedador es el grupo sulfato de los factores de nodulación de S. meliloti. Las cepas mutantes de S. meliloti que producen factores Nod sin el grupo sulfato ya no son capaces de nodular en alfalfa.

Los genes de la nodulación se definen como aquellos genes de rizobio que son necesarios para la nodulación o que se expresan coodinadamente con estos. Aunque los llamamos de modo general como genes nod, comprenden a genes designados como nod, nol y noe. Estos genes están generalmente agrupados bien en plásmidos o en una región del cromosoma. Los plásmidos que llevan los genes nod se llaman simbióticos o pSym y pueden llegar a ser tan grandes como un tercio del total del cromosoma como en S. meliloti. En cepas de Rhizobium el tamaño del pSym es menor (200-600 kb) y cuando estas cepas se curan del plásmido simbiótico ya no son capaces de nodular mientras que la reintroducción de un pSym homólogo o heterólogo restaura la nodulación. Recientemente se ha determinado la secuencia total del plásmido simbiótico de Rhizobium sp. NGR234. En M. loti los genes nod se localizan en el cromosoma, pero se ha demostrado que la región del cromosoma donde se localizan junto a otros genes necesarios para la simbiosis, puede transferirse de unas cepas a otras en la rizosfera y es por ello que a esta región de aprox. 500 kb se le llama isla simbiótica en analogía a las islas de patogenicidad descritas para bacterias patógenas.

La biosíntesis del esqueleto de los factores Nod es catalizada por los productos de los genes nodA, nodB, y nodC (Fig. 6). La proteína NodC presenta actividad N-acetilglucosamina β 1 —> 4 transferasa (quitina sintasa); NodB es una deacetilasa que elimina el grupo acetilo del extremo no reductor y NodA transfiere el ácido graso a esta posición (Fig. 6). Existen muchos otros genes involucrados en la modificación específica de la estructura básica del factor Nod en las diferentes especies de rizobio. En la Tabla 10 se describen los genes de nodulación para los cuales se conoce o se ha propuesto una función. Por ejemplo, nodH codifica la sulfotransferasa que transfiere un grupo sulfato al extremo reductor de los factores Nod, mientras que nodPQ sintetizan la forma activada del sulfato que va a transferir NodH. Otro gen que determina rango de hopedador es nodZ, cuyo producto es una fucosil transferasa que añade fucosa al extremo reductor del factor Nod. Los productos de los genes nodF y nodE se requieren para la biosíntesis de ácidos grasos poliinsaturados. La presencia de éstos es necesaria para la nodulación de leguminosas del llamado "grupo galegoide". Por otra parte, la capacidad de un determinado rizobio de producir factores Nod con estructuras diferentes se ha relacionado con la amplitud en el rango de hospedador.

Los factores Nod purificados son capaces de inducir en la planta reacciones similares a las que producen los rizobios. De modo significativo, son capaces de inducir la división en células ya diferenciadas del cortex de la planta (Animación 3). Es por ello que a los factores Nod se les llama morfógenos y se ha sugerido que su estructura pueda imitar a señales u hormonas de la propia planta, aún no identificadas.

Polisacáridos y componentes de superficie: Otros componentes de la bacteria requeridos para una simbiosis efectiva

Como se ha descrito en las secciones anteriores, los factores Nod tienen un papel clave en la inducción de las etapas iniciciales de nodulación. Sin embargo, otros requerimientos son necesarios para la formación de nódulos simbióticamente efectivos. De hecho, en estados más tardíos del proceso de infección tales como la formación y elongación del canal de infección, así como la liberación de bacterias en el citoplasma de las células infectadas (Animación 2), requieren constituyentes de superficie de los rizobios. Los polisacáridos que han sido estudiados en relación a su función en simbiosis son: exopolisacáridos (EPSs), lipopolisacáridos (LPSs), antígenos de tipo K (KPSs) y glucanos cíclicos En muchos casos los mutantes presentan diferentes fenotipos simbióticos dependiendo de la pareja planta-rizobio o un mismo mutante presenta diferentes fenotipos dependiendo de la planta (Tablas 11 y 12). Existe una gran cantidad de estudios relacionados con las estructuras, los genes de rizobio implicados en su biosíntesis, así como los fenotipos simbióticos de los diferentes mutantes y sus posibles funciones.

Las cepas silvestres de rizobio suelen producir grandes cantidades de exopolisacáridos (EPSs) y forman colonias muy mucosas en los medios de laboratorio. Se han elucidado las estructuras de los EPSs producidos por más de 20 cepas de rizobio. En la Figura 7 se muestran las unidades repetitivas de los EPSs mejor conocidos. En S. meliloti 1021 se han identificado dos tipos de EPS llamados como EPS I (succinoglucano) y EPS II (galactoglucano) (Fig. 7). En ambos casos, se distingue una fracción de alto peso molecular y otra de bajo peso molecular. Tanto los genes para la biosíntesis de EPS I (exo y exs) como para EPS II (epx) están localizados en el megaplásmido b, por lo que también se le llama como pExo.

Mutantes de S. meliloti deficientes en la producción de EPS I no llegan a infectar las plantas de alfalfa. Sin embargo, la función de EPS I puede ser reemplazada por EPS II, que es normalmente críptico. En otra cepa de S. meliloti, en ausencia de EPS I y de EPS II se produce un polisárido capsular (KPS) que permite una simbiosis normal. Un descubrimiento importante sobre la función del EPS ha sido que la adición de fracciones de bajo peso molecular puede complementar el defecto fenotípico de mutantes en EPSs. Se sugiere que los EPSs están implicados en suprimir la reacción de defensa de la planta y parecen ser requeridos para la formación del canal de infección.

Como otras bacterias Gram-negativas, los rizobios producen una monocapa de lipopolisacárido que se proyecta hacia el exterior. La estructura del LPS se divide en tres partes: lípido A, núcleo oligosacarídico y antígeno O. El lípido A consiste en un oligosacárido al que se unen ácidos grasos y es la parte hidrofóbica que ancla toda la molécula en la membrana externa. El antígeno O es una cadena polisacarídica de gran peso molecular, que es altamente variable de cepa a cepa y le confiere propiedades antigénicas. Hay muchos ejemplos de mutantes de rizobio que carecen de antígeno O y son defectivos en el proceso de infección (Tablas 11 y 12). En general, los EPSs se requieren para nodular plantas que forman nódulos indeterminados (ej. alfalfa) y los LPSs para nodular plantas que forman nódulos indeterminados (ej. frijol). Como en el caso de EPS y KPS, se ha propuesto que el LPS funcione como señal o bien sea necesario para evadir la repuesta de defensa de la planta.

Los beta-glucanos cíclicos son moléculas cíclicas de glucosa. En los generos de Sinorhizobium y Rhizobium las glucosas están unidas exclusivamente por enlaces β-(1—>2) y en las especies de Bradyrhizobium por enlaces β-(1—>3) y β-(1—>6) (Figura 8). Los beta-glucanos están presentes en el periplasma y también se secretan al medio. Su producción aumenta a baja osmolaridad y parece ser esencial para una osmoadaptación adecuada. Los mutantes de rizobio que no producen glucanos cíclicos presentan un fenotipo pleotrópico y no son capaces de llevar a cabo una simbiosis efectiva (Tablas 11 y 12). No se conoce la función de los beta-glucanos en simbiosis, como para el caso de otros polisacáridos de superficie se propone que funcionan como supresores de la respuesta de defensa de la planta. También se ha propuesto que pueden funcionar en el transporte de ciertas moléculas, bien moléculas señal o para retirar sustancias tóxicas.

Funcionamiento del nódulo

La fijación simbiótica de nitrógeno en rizobio se lleva a cabo en los bacteriodes que se encuentran en el citoplasma de las células del nódulo. La enzima nitrogenasa cataliza la reacción:

N₂ + 8H⁺ + 8e^- + 16 Mg-ATP ——> 2NH₃ + H₂ + 16 Mg-ADP + 16Pi

La nitrogenasa es un proteína de gran tamaño que consiste de dos componentes, la proteína homodimérica que contiene Fe y es codificada por nifH, y la proteína tetramérica que contiene Fe y molibdeno (Mo), codificada por los genes nifD y nifK. La nitrogenasa de los nódulos radiculares posee características similares a la enzima de las bacterias fijadoras de nitrógeno en vida libre, incluyendo la sensibilidad al O₂ y la capacidad de reducir acetileno y N₂. La formación de H₂ es parte del mecanismo de la nitrogenasa, pero representa una pérdida significativa de energía. En algunas especies de rizobio existe una hidrogenasa (codificada por los genes hup) que es capaz de reciclar el H₂ formado por la nitrogenasa, que resulta en un uso más eficiente de la energía. Es por ello, que se ha impulsado la transferencia de los genes hup a todas las cepas de rizobio para la inoculación en el campo.

Los bacteroides dependen totalmente de la planta para obtener la energía necesaria para la fijación de nitrógeno. Los principales compuestos orgánicos transportados al interior de los bacteroides a través de la membrana peribacteroidal son los intermediarios del ciclo del ácido cítrico, en particular los ácidos de cuatro carbonos succinato, malato y fumarato (Fig. 9). Estos ácidos son utilizados como donadores de electrones para la producción de ATP y, tras su conversión en piruvato, como última fuente de electrones para la reducción del N₂. El primer producto estable que se obtiene de la fijación de N₂ es el amonio, y varias pruebas indican que la asimilación del amonio para formar compuestos de nitrógeno orgánico en los nódulos radicales lo lleva principalmente la planta. El amonio también se puede asimilar en los bacteroides y puede ser transferido a la planta en forma de alanina (Fig. 9).

Durante el proceso de simbiosis la planta también expresa proteínas específicas del nódulo a las que se llama nodulinas. Entre ellas, la leghemoglobina tiene la función de aportar O₂ a los bacteroides y de controlar los niveles O₂. La leghemoglobina se localiza en el citosol de las celulas de la planta infectada por bacteroides y es la que confiere el típico color rojo o rosado de los nódulos funcionales (Fig. 1 y Fig 10).

Perspectivas

Hay muchos aspectos aún no bien entendidos en la simbiosis rhizobio-leguminosa, y la información actual proviene del estudio de sólo unas pocas especies, no representando la gran variabilidad presente en la naturaleza. La investigación de esta simbiosis continúa activamente tanto por su interés en agricultura como por el interés en el estudio del sofisticado proceso de interacción entre procariontes y eucariontes. Recientemente se ha secuenciado el genoma completo de S. meliloti, y varios proyectos de secuenciación de rhizobios están en marcha, por ejemplo, en México se está secuenciando el genoma de R. etli. Asímismo, se están secuenciando varias plantas leguminosas (Lotus japonicus, Medicago truncatula). Con estos proyectos de secuenciación se identificará los genes de estos organismos. El reto para las investigaciones futuras será determinar la función específica de cada gen, y en particular de aquellos implicados en la simbiosis.