Gloria Soberón
Instituto de Biotecnología, Universidad Nacional Autónoma de México Introducción Pseudomonas aeruginosa es una bacteria gram-negativa perteneciente a la rama γ de las proteobacterias, misma a la que pertenecen las enterobacterias(Fig. 1)(54,84).Dentro del género Pseudomonas se encuentran también algunas otras especies como P. fluorescens, P. putida, P. syringae y P. alcaligenes. P. aeruginosa se encuentra ampliamente distribuida en la naturaleza(11,31),se puede aislar de muestras de suelo, aguas pristinas y contaminadas, asi como de plantas y animales. Todas las cepas son potencialmente patógenas para el hombre y algunas pueden infectar también a plantas como Arabidopsis thaliana(62),y a invertebrados como Caenorhabditis elegans(73).Esta bacteria es capaz de utilizar una enorme variedad de compuestos orgánicos como sustrato para crecer, capacidad que le permite colonizar nichos en los que son escasos los nutrimentos que otros organismos pueden asimilar. Se ha reportado el aislamiento de P. aeruginosa de ambientes tan inhóspitos como son el combustible de avión, soluciones de clorhexidina y el jabón(31). Para empezar este capítulo es interesante mencionar que P. aeruginosa tiene importancia para el hombre tanto porque le representa problemas, como porque puede ser útil en el tratamiento de la contaminación ambiental(Fig. 2).Contrariamente a lo que parece, todos nosotros estamos en contacto diariamente con Pseudomonas aeruginosa, ya que se encuentra en bajas cantidades en nuestros alimentos y en algunos artículos de limpieza(31).De hecho, se obtienen aislamientos de esta bacteria a partir de entre el 2 y el 8% de las heces de personas sanas(31),lo que nos muestra que nuestro contacto con esta bacteria es cotidiano y sólo representa una amenaza para nuestra salud en condiciones especiales, como veremos a continuación. P. aeruginosa representa un problema importante de salud en centros hospitalarios, especialmente cuando se trata de pacientes con cancer(1)o quemados(41).Una vez que se establece la infección, P. aeruginosa produce una serie de compuestos tóxicos que causan no sólo daño tisular extenso, sino adicionalmente interfieren con el funcionamiento del sistema inmune(18, 46).Entre las proteínas que intervienen en la infección de P. aeruginosa encontramos toxinas, como las exotoxinas A y S, así como enzimas hidrolíticas que degradan las membranas y el tejido conjuntivo de diversos órganos(18,46).Esta situación se ve agravada por la dificultad para tratar las infecciones por P. aeruginosa, ya que esta bacteria presenta una muy alta resistencia natural a distintos antibióticos y a desinfectantes(30,72). Existe un grupo poblacional especialmente vulnerable a las infecciones con P. aeruginosa formado por los enfermos de fibrosis quística(26,27,59).P. aeruginosa coloniza muy eficientemente el tracto respiratorio de estos pacientes, y a medida que progresa la infección se seleccionan derivados mucoides de la bacteria que producen grandes cantidades del exopolisacárido alginato(Fig. 3).Una vez que se establece una infección por cepas mucoides de P. aeruginosa en los pulmones de pacientes con fibrosis quística, estos están en la etapa terminal de la enfermedad. Esto se debe a que estas cepas no pueden ser eliminadas por el sistema inmune y, hasta el momento, no existe un tratamiento efectivo contra cepas mucoides. Por otra parte, en ambientes acuosos esta bacteria se adhiere a superficies, produciendo una especie de agregado llamado biopelícula(12)(Fig. 4).La formación de estos cúmulos de bacterias y material extracelular representa un problema de salud pues contamina dispositivos que se implantan dentro del cuerpo, como por ejemplo dispositivos intrauterinos, catéteres(48)o válvulas cardiacas. Las biopelículas también representan un problema en el proceso de producción de diversas industrias pues provocan taponamiento y corrosión de conexiones y filtros. Asimismo, P. aeruginosa presenta problemas en la industria alimentaria ya que puede descomponer los alimentos que se mantienen en refrigeración al mantener un metabolismo basal en estas condiciones y producir enzimas hidrolíticas(69). Sin embargo, a la vez que P. aeruginosa causa al hombre distintos problemas, esta bacteria tiene diversas aplicaciones biotecnológicas, sobre todo en el área ambiental. Así se sabe que es uno de los pocos organismos capaces de degradar alcanos de cadena ramificada(65);que produce biosurfactantes que son útiles para la limpieza de suelos contaminados con hidrocarburos(42)o con metales pesados(45);y que produce enzimas, como la lipasa, con distintas aplicaciones potenciales(69). Desde un enfoque básico P. aeruginosa representa un modelo de gran interés que, como veremos más adelante, ha sido estudiada desde múltiples enfoques. De hecho P. aeruginosa es una de las bacterias más estudiadas a nivel molecular y su genoma ha sido totalmente secuenciado recientemente(72,www.pseudomonas.com).En este capítulo revisaremos brevemente distintos aspectos de la biología de esta bacteria que tiene tantas y tan diversas relaciones con el hombre. Dentro de esta introducción es importante mencionar que P. aeruginosa sobresale entre las bacterias por su extraordinaria capacidad de adaptación, ya que, como mencioné anteriormente, vive en ambientes muy diversos. Muchos autores incluso la han considerado como un organismo ubicuo(11,31,72,www.pseudomonas.com)aunque no se ha documentado su presencia en ambientes extremos. Por otra parte, es el único caso conocido de una bacteria ambiental en la que todos los aislamientos son potencialmente patógenos para el hombre(11,31,72,www.pseudomonas.com).Es también una característica particular de esta bacteria el arreglo de los genes que intervienen en la virulencia de la bacteria, ya que no están codificados en las llamadas "islas de patogénesis" como en las demás bacterias patógenas(29),sino se encuentran interdispersas en su cromosoma(72,www.pseudomonas.com). La colonización de distintos ambientes por P. aeruginosa y la patogenia de los aislamientos ambientales nos plantean interrogantes evolutivas muy importantes que hacen fascinante el estudio de P. aeruginosa. Entre otras podemos hacernos las siguientes preguntas: ¿qué ventaja selectiva le da la producción de los factores de virulencia a P. aeruginosa viviendo en el medio ambiente? ¿cómo puede P. aeruginosa adaptarse a ambientes tan diversos?, y ¿por qué es distinto el arreglo genético de los genes que intervienen en la virulencia de la bacteria al de otras bacterias patógenas? El estudio de esta bacteria nos permitirá, pues, contestar problemas fundamentales acerca de la manera en la que se adapta a múltiples condiciones ambientales. Estructura del Genoma Recientemente se concluyó la secuencia completa del genoma de la cepa PAO1, que es la cepa tipo de P. aeruginosa y que fue aislada de un paciente con otitis media. Esta secuencia ya se encuentra disponible en el internet(www.pseudomonas.com)y su análisis fue recientemente publicado(72).El tamaño aproximado del único cromosoma circular(www.pseudomonas.com)que forma el genoma de esta bacteria es de cerca de 6.3 millones de pares de bases, con mucho el de mayor tamaño de los genomas de bacterias secuenciados hasta ahora(Tabla 1).Esta cepa, al igual que muchos otros aislamientos de P. aeruginosa, no contiene plásmidos. Más de la mitad de los genes de P. aeruginosa PAO1 presentan una homología cercana y un arreglo transcripcional en operones similar a los de Escherichia coli(71,72).También es aparente que P. aeruginosa presenta homología en la secuencia y en la organización genética con bacterias ambientales, incluso con bacterias gram-positivas(71,72).El 32% de los genes predichos a partir de la secuencia del genoma de esta bacteria no tienen homología con las secuencias depositadas en los bancos de datos, lo que sugiere que se trata de genes que codifican para actividades enzimáticas novedosas(71,72).Del análisis del genoma de esta bacteria es notorio la gran abundancia de genes que parecen codificar para bombas que sacan compuestos de la célula(71,72).La abundancia de estos transportadores pudiera estar relacionada con su alta resistencia a distintos compuestos tóxicos(49,88)y, en última instancia, con su extraordinaria versatilidad. El proyecto de secuenciación del genoma de la cepa PAO1 fue realizado por la fundación para la Fibrosis Quística, la universidad de Washington, y la companía PathoGenesis. El interés de estas organizaciones es fundamentalemnete clínico, ya que su objetivo principal es encontrar nuevos fármacos y otras herramientas para combatir las infecciones por P. aeruginosa. Variabilidad Genética Contrariamente a lo que ocurre con otras bacterias patógenas, no existen clonas de P. aeruginosa asociadas con el desarrollo de una enfermedad, por lo que la frecuencia de las distintas clonas es la misma entre los aislamientos ambientales y clínicos(63).Esto es, en una determinada región geográfica se encuentra que la frecuencia con la que se aisla una cepa es la misma si se muestrean hospitales, pacientes con distinto tipo de infecciones o se toman muestras ambientales(63).Sin embargo existe una gran variabilidad genética entre distintos aislamientos de esta bacteria aún aisladas en la misma región. Esta variabilidad tiene características muy particulares(37,77),como a continuación veremos. El tamaño del genoma de distintas cepas de P. aeruginosa varía entre 5 y 7 millones de pares de bases, y comprende un mosaico de genes específicos de la especie que va del 70 al 90% de la secuencia de DNA de una cepa. Esta proporción varía de acuerdo con la cantidad de información accesoria que cada cepa tiene, pero el orden de los genes propios de la especie está conservado entre todos los aislamientos. Estos bloques de DNA se interrumpen por secuencias específicas de cada cepa que pueden ser de entre 1 a 200 kb. La secuencia de los genes comunes está altamente conservada entre los distintos aislamientos de esta bacteria, a excepción del gen pilA que codifica para la fimbria tipo IV y que presenta un gran polimorfismo. De hecho la variabilidad de las secuencias específicas de P. aeruginosa es 10 veces menor que la que presentan distintas cepas de E. coli o Salmonella, lo que sugiere una alta tasa de recombinación entre la población de esta bacteria. La alta frecuencia de recombinación entre las distintas clonas, comparada con la relativamente menor tasa de mutación espontánea, mantiene una información genética común a toda la especie. De este modo, P. aeruginosa tiene una parte de su genoma altamente conservada y una proporción menor, pero significativa, que es distinta en cada clona de esta bacteria. La alta conservación entre cepas de la mayor parte del genoma de P. aeruginosa, aunada a la presencia de genes clona específico, podría explicar la capacidad de esta bacteria de colonizar tan diversos nichos y de utilizar como sustrato una gran variedad de compuesto. En un determinado nicho ecológico toda la población bacteriana puede explotar toda la información genética propia de la especie y, al mismo tiempo, cada clona contiene secuencias propias que son blanco de una acelerada evolución genética. Plásmidos Una de las características de las bacterias del género Pseudomonas es su gran capacidad para catabolizar distintos hidrocarburos aromáticos y alifáticos. Esta característica generalmente está codificada en plásmidos, llamados catabólicos(22),que casi siempre se encuentran en cepas de P. putida y rara vez en P. aeruginosa. En el caso de esta última bacteria su enorme versatilidad metabólica parece deberse al gran número de genes cromosomales que codifican para enzimas con actividades novedosas(72).Los plásmidos que se presentan en P. aeruginosa codifican para resistencias a antibióticos(28)o a metales(8,67),y su extensa distribución representa un problema clínico. Es interesante mencionar que si bien son frecuentes los plásmidos que confieren resistencia a antibióticos y metales pesados entre los aislamientos de P. aeruginosa, no lo son tanto como para considerar que estos elementos genéticos formen parte de su genoma. Por otra parte, no existen datos que sugieran que los plásmidos tengan un papel en la alta tasa de recombinación que presenta esta bacteria. Algunos plásmidos originalmente aislados de cepas de P. aeruginosa fueron importantes para la construcción del mapa genético de esta bacteria(34,35).Además, ya que estos plásmidos pueden replicarse en distintos fondos genéticos, han sido utilizados en el estudio genético de distintas bacterias gram-negativas, diferentes a las enterobacterias(33,61).También tienen importancia dentro de la ingeniería genética pues a partir de ellos se han construido múltiples vectores de clonación capaces de replicarse en diversas bacterias gram-negativas(61,79). Resistencia Natural a Antibióticos La membrana externa de las bacterias gram-negativas es una membrana semipermeable que permite la difusión de solutos hidrofílicos pequeños y tiene muy baja permeabilidad para los compuestos hidrofóbicos(87).La permeabilidad de la membrana externa depende principalmente de las porinas, que son proteinas formadoras de poros con una baja especificidad(86),y de los sistemas de transporte específicos(78)(Fig. 5). La baja permeabilidad de las porinas de la membrana externa de P. aeruginosa tiene un papel importante en el alto nivel de resistencia natural a los antibióticos de esta bacteria(30). Sin embargo, es claro que en P. aeruginosa, tanto la resistencia a antibióticos intrínseca como la adquirida, dependen principalmente de la presencia de un gran número de transportadores que secretan estos compuestos al exterior de la célula. El mayor número de estos transportadores se agrupan en dos familias, segun su parecido estructural, una de ellas está formada por los sistemas llamados eflux(49,88),y la otra se denomina MFS, por sus siglas en inglés (major facilitator superfamily)(72).Es notorio la gran abundancia de estos dos tipos de transportadores en el genoma de la cepa PAO1 comparado con el número encontrado en otras bacterias como E. coli(72,www.pseudomonas.com).Los sistemas eflux están formados por tres proteinas, un intercambiador droga-protón, presente en la membrana interna, una proteina de membrana externa que parece formar un canal y una proteina periplásmica que une a las dos proteinas membranales(Animación 1)(88).El sistema eflux que más contribuye a la resistencia intrínseca de P. aeruginosa es el sistema AcrAB/MexAB que es capaz de transportar una amplia variedad de antibióticos como: quinolonas, macrolidos, cloranfenicol, tetraciclina, trimetroprima y β-lactámicos(60).Además de los antibióticos, el sistema AcrAB/MexAB también puede translocar soventes orgánicos(60). "Sistema Sensor de Quorum" Pseudomonas aeruginosa, al igual que otras bacterias cuenta con múltiples sistemas regulatorios que le permiten modificar la expresión de distintos genes en respuesta de cambios en el medio ambiente. Es más, se trata de la bacteria en la que se ha encontrado la mayor proporción de genes que codifican para proteínas que son potencialmente reguladores transcripcionales(72).Uno de estos sistemas regulatorios, que también está presente en muchas otras bacterias, responde no directamente a las condiciones medio ambientales, sino fundamentalmente a cambios en una población bacteriana, ya que promueve el cambio en la expresión genética en función de la densidad celular. Este sistema regulatorio detecta cuándo se ha llegado a una masa crítica de bacterias por lo que se le ha denominado "sensor de quorum"(24,25,64).El mecanismo mediante el cual se regula la expresión genética en altas densidades celulares se basa en la producción baja y constante por cada célula de un compuesto difusible llamado autoinductor(Fig. 6 y7).Cuando el número de células llega a cierto umbral en el que la concentración del autoinductor es suficientemente elevada, este compuesto interacciona y activa a cierto activador transcripcional que, a su vez, cambia el patrón de expresión génica(Fig. 6 y7)(24,25,64).En un gran número de bacterias gram-negativas los autoinductores son derivados acilados de la lactonas de homoserina. P. aeruginosa contiene más de un sistema "sensor de quorum"(24,25),dos de estos sistemas denominados Las y Rhl, han sido muy bien caracterizados a nivel molecular y serán los que revisaré en este capítulo. Sin embargo, recientemente fue reportado mediante el análisis de la secuencia del genoma de la cepa PAO1 un tercer regulador transcripcional de la familia de los activadores de la respuesta sensora de quorum llamado QscR, que a diferencia de los otros dos sistemas mencionados, tiene un papel negativo en la regulación de la respuesta sensora de quorum(10). Pseudomonas aeruginosa, al igual que otras bacterias cuenta con múltiples sistemas regulatorios que le permiten modificar la expresión de distintos genes en respuesta de cambios en el medio ambiente. Es más, se trata de la bacteria con la mayor proporción de genes que codifican para proteínas que son potencialmente reguladores transcripcionales(72).Uno de estos sistemas regulatorios, que también está presente en muchas otras bacterias, responde no directamente a las condiciones medio ambientales, sino fundamentalmente a cambios en una población bacteriana, ya que promueve el cambio en la expresión genética en función de la densidad celular. Este sistema regulatorio detecta cuándo se ha llegado a una masa crítica de bacterias por lo que se le ha denominado "sensor de quorum"(24,25,64).El mecanismo mediante el cuál se regula la expresión genética en altas densidades celulares se basa en la producción baja y constante por cada célula de un compuesto difusible llamado autoinductor(Fig. 6 y7).Cuando el número de células llega a cierto umbral en el que la concentración del autoinduuctor es suficientemente elevada, este compuesto interacciona y activa a cierto activador transcripcional que, a su vez, cambia el patrón de expresión génica(Fig. 6 y7)(24, 25,64). En un gran número de bacterias gram-negativas los autoinductores son derivados acilados de la lactonas de homoserina. P. aeruginosa es la única bacteria gram-negativa reportada a la fecha que contiene más de un sistema "sensor de quorum"(24,25).Dos de estos sistemas denominados Las y Rhl, han sido muy bien caracterizados a nivel molecular y serán los que revisaré en este capítulo. Sin embargo, recientemente detectamos mediante el análisis de la secuencia del genoma de la cepa PAO1 un tercer regulador transcripcional de la familia de los activadores de la respuesta sensora de quorum. Denominamos PhzR a este tercer regulador por estar ligado a los genes phz encargados de la síntesis de piocianina. Se sabe que los sistemas Las y Rhl participan de una manera central en la expresión de los genes que tienen que ver con la virulencia de P. aeruginosa, a los que me referí en la introducción de este capítulo. Se sabe, también, que estos dos sistemas reguladores interaccionan entre si de una manera muy compleja para promover la expresión de los genes involucrados en la patogénesis de P. aeruginosa(38,56,57,58)(Animación 2). El sistema "sensor de quorum" basado en el activador transcripcional LasR promueve la transcripción de distintas proteasas involucradas en la virulencia de esta bacteria como son las elastasas A y B y la proteasa alcalina, asi como la exotoxina S(51,52)(Animación 2).El autoinductor con el que interacciona LasR es el N-(3-oxododecanoil)-homoserina lactona, o PAI1, que se sintetiza por la reacción catalizada por la enzima sintetasa de autoinductor LasI(51,52).Este sistema "sensor de quorum" sólo depende de la densidad celuar y no de la composición del medio de cultivo, por lo que se supone que se expresa siempre que se alcanza una elevada densidad de P. aeruginosa, como sería el caso de cualquier tipo de infección. La proteina RhlR promueve la transcripción de los genes rhlAB(Animación 2)que codifican para una de las enzimas que producen el biosurfactante ramnolípido(2,51,52).Se ha reportado que otros metabolitos que también participan en la virulencia de la bacteria(Animación 2),como la piocianina(3,13),están también bajo el control del sistema Rhl(2,52)El autoinductor con el que interacciona RhlR es el N-(butanoil)-homoserina lactona, o PAI2 que es producido por la autoinductor sintetasa RhlI. La transcripción del gen rhlR depende de la activación por LasR-PAI1, por lo que los dos sistemas "sensor de quorum" forman una cascada regulatoria encabezada por LasR(Animación 2)(38,56,57,58).El sistema Rhl, a diferencia del sistema Las, sólo se expresa en condiciones de limitación de ciertos nutrimentos, como el fosfato o el nitrógeno, de modo que en un medio rico, aún en altas densidades celulares, no se expresan los factores regulados por RhlR(56).Aún no se conocen los sistemas reguladores que determinan la expresión diferencial del sistema Rhl dependiendo de la disponibilidad de nutrimentos. Virulencia en Plantas e Invertebrados En un muestreo de cepas de P. aeruginosa se determinó que el aislamiento clínico PA14 era capaz de infectar a la planta Arabidopsis thaliana, y que utilizaba factores de virulencia comunes para infectar a esta planta y al ratón, que fue el modelo animal usado(61).Asimismo, posteriormente se demostró que la cepa PA14 era capaz de infectar al gusano Caenorhabditis elegans causandole una muerte rápida (4 a 24 hrs) en un medio con alta sal, o una muerte lenta (2 a 3 días) en un medio con baja sal (73). Se analizó un grupo de mutantes de la cepa PA14 que ya no eran capaces de matar a C. elegans mediante la infección rápida y se encontró que algunas mutantes, como las afectadas en el gen mexA (involucrado en los sistemas eflux) y en dos genes sin homólogos conocidos, tenían además una reducción significativa en su virulencia en ratones(73).Por otra parte, una mutante en el gen phzB que codifica para una enzima en la vía de producción de la piocianina, presenta sólo una reducción del 18% en su virulencia al ratón. Mientras que la mutante en el gen hrpM, que codifica para un factor de virulencia en plantas, no disminuye la capacidad de infección a estos roedores. En cuanto a los factores involucrados en la infección lenta, se han identificado mutantes en diversos reguladores transcripcionales como gacS, lasR y mtrR (que regula la expresión del sistema eflux AcrAB/MexAB), que muestran una reducción en su virulencia en ratones del 50%(73). Estos resultados muestran que algunas cepas de P. aeruginosa tiene la capacidad de infectar huespedes tan diversos como son plantas, animales invertebrados y mamíferos, y que algunos factores de virulencia participan en todas estas interacciones patogénicas, mientras que otros factores sólo participan en alguna de ellas. Ya que todas las cepas de P. aeruginosa son patógenas para ratones, mientras que sólo un grupo de ellas pueden infectar A. thaliana y a C. elegans, se puede concluir que dentro de la información especie específica se encuentra codificada la capacidad de causar enfermedad en mamíferos y que el resto de interacciones patogénicas se debe a información sólo presente en ciertas clonas. La cepa PA14 resulta un modelo muy interesante en el estudio de la interacción patogénica ya que se ha demostrado que este aislamiento también es capaz de infectar a la mosca Drosophila melanogaster, al gusano Galleria mellonella y al hongo Dictyostelium discoideum. Se ha reportado que una mutante en el gen lasR de la cepa PA14 tiene una virulencia disminuida en todos los modelos antes mencionados, así como en ratón y en plantas. Esto muestra que la respuesta sensora de quorum juega un papel central en la patogenia de P. aeruginosa. Varios de los modelos eucariotes con los que la cepa PA14 presenta una interacción patogénica presentan un sistema genético bien definido y en algunos casos, como C. elegans y D. melanogaster se cuenta ya con la secuencia completa de sus genomas, o parcial en el caso de A.. thaliana. Esto permitirá que en un futuro cercano se conozcan los elementos del huésped que están involucrados en la infección por P. aeruginosa. Producción de Alginato La inmensa mayoría de los aislamientos clínicos o ambientales de P. aeruginosa son cepas no mucoides, ya que producen cantidades muy pequeñas del exopolisacárido llamado alginato(11).Sin embargo, como mencioné antes, en los pulmones de los enfermos de fibrosis quística se seleccionan muy frecuentemente cepas mucoides, que son el factor principal de morbilidad y mortalidad en estos pacientes(26,27,59).Esta situación ha promovido el estudio de la producción de alginato por P. aeruginosa. El alginato es un copolímero lineal con enlaces β-1,4 de D-manuronato y su epímero C-5, L-guluronato(Fig. 8).La vía de su biosíntesis ha sido completamente dilucidada desde hace varios años(Animación 3)(44).Asimismo se conocen con gran detalle los mecanismos regulatorios que intervienen en el control de la expresión de este polisacárido(44). Se ha determinado que la causa más frecuente de la conversión a mucoidía de las cepas de P. aeruginosa en los pulmones de los pacientes con fibrosis quística es la mutación en el gen que codifica para la proteina MucA, que es un factor anti-sigma(17,33,43,66,84).Veamos lo que esto significa. En bacterias la RNA polimerasa está constituida por varias subunidades, y una de ellas, la subunidad sigma, determina qué genes van a ser transcritos por la enzima. De este modo, los genes del metabolismo general de la bacteria tienen una secuencia característica que los hace ser reconocidos por la RNA polimerasa conteniendo el factor sigma D. Otros genes, como aquellos que se expresan en estrés calórico o en la fase estacionaria de crecimiento son transcrito por la RNA polimerasa con otros factores sigma, llamados alternativos. Los genes que codifican para las enzimas biosintéticas de alginato en P. aeruginosa son transcritos por la RNA polimerasa asociada con el factor sigma AlgU, o sigma E. En las cepas silvestres de P. aeruginosa el factor anti-sigma MucA inactiva al factor sigma AlgU(Fig. 9).En los pulmones de los enfermos de fibrosis quística se seleccionan mutantes mucA que inactivan a este factor anti-sigma y, por tanto, tienen una alta actividad de AlgU que promueve una alta transcripción de los genes biosintéticos para alginato. Es interesante mencionar que los aislamientos mucoides de enfermos de fibrosis quística producen muy bajos niveles de proteasas y otros factores de virulencia regulados por el sistema sensor de quorum Las(46),pero producen niveles normales o elevados de ramnolípidos, que se regula por el sistema sensor de quorum Rhl(50).Hasta el momento no se conocen los mecanismos regulatorios que causan este fenómeno. Formación de Biopelículas Cuando P. aeruginosa se adhiere a una superficie, las células se diferencian para formar microcolonias cubiertas por una matriz extracelular que eventualmente llegan a constituir una película(12).Las biopelículas tienen una estructura muy compleja, en la que se pueden distinguir canales por los que se intercambian oxígeno y otros sustratos con la fase acuosa(Fig. 3). La matriz extracelular está constituida en parte por alginato(15),pero éste no constituye el material más abundante. Las bacterias que forman la biopelícula tienen un metabolismo distinto a las celulas que crecen en medios líquidos (llamadas planctónicas), uno de las diferencias más aparentes es su disminuida sensibilidad a antibióticos y otros agentes tóxicos(12,48).Se considera que la mayor proporción de las células de P. aeruginosa que viven en el medio ambiente se encuentran formando biopelículas(12).Asimismo, el análisis microscópico de los pulmones de pacientes con fibrosis quística muestra que P. aeruginosa también se encuentra dentro de este tipo de estructuras(38). Recientemente se demostró que el sistema Las "sensor de quorum" tiene un papel central en la formación de biopelículas, ya que mutantes en el gen lasI no producen estas esctructuras, salvo en el caso en el que se adiciona el autoinductor PAI1(16). Motilidad P. aeruginosa tiene dos formas de desplazarse, en medios líquidos se desplaza "nadando" mediante un único flagelo polar(40),mientras que sobre las superficies se mueve, independientemente de la presencia del flagelo, por un mecanismo llamado "twitching" que depende de las fimbrias o pili tipo IV(33),estos dos tipos de desplazamiento están involucrados en la formación de biopelículas(76).Por otra parte el análisis de la secuencia de la cepa PAO1, predice que P. aeruginosa, codifica para un total de cuatro sistemas de quimotaxis y motilidad(72),dos de los que no han sido analizados funcionalmente aún. Los genes de P. aeruginosa que codifican para el flagelo y los que regulan su movimiento y que, por tanto, están involucrados en la quimiotaxis de la bacteria, tienen gran homología con los de E. coli y otras bacterias gram-negativas. Es interesante, sin embargo, que en P. aeruginosa y P. putida existe un gen llamado motR(7)o fleN(14),sin otros homólogos conocidos, que en P. aeruginosa regula el número de flagelos(Fig. 10 y11)y la velocidad de nado. Esto es, mutantes en el gen motR tienen múltiples flagelos y se desplazan a mucho mayor velocidad que la cepa silvestre. Al seleccionar mutantes afectadas en la formación de biopelículas se obtuvieron, entre otras, algunas que tenían inactivado el gen motR (datos no publicados). El desplazamiento tipo "twitching" es característico de P. aeruginosa y depende de las fimbrias tipo IV(29),que determinan la adhesión e infección de la bacteria a las células epiteliales del huésped(81).Se han descrito más de 35 genes involucrados en la biogénesis, regulación y funcionamiento de la fimbria tipo IV de P. aeruginosa(81).Muchos de estos genes tienen homología con genes involucrados en la secreción de proteínas y la incorporación de ADN a la célula en distintas bacterias. En interesante mencionar que el activador transcripcional AlgR, que activa los genes para la biosíntesis de alginato, tiene un papel central en la expresión de la fimbria tipo IV(80).Asimismo, se encontró que la proteina regulatoria ChpA determina el movimiento twitching, la producción de alginato y también diversos factores regulados por el sistema "sensora de quorum".Esta proteína ChpA es un regulador transcripcional que modula la expresión de un sistema multifactorial de transducción de señales, análogo, pero más complejo, que el que regula la quimotaxis en otras bacterias al controlar la rotación del flagelo(81).Se desconoce el significado fisiológico de la interacción regulatoria entre la producción de alginato, el movimiento twitching, y la respuesta "sensora de quorum". Secreción de proteínas Practicamente todas las bacterias gram-negativas secretan proteínas al medio extracelular. Estas exoproteínas tienen que atravesar la envoltura celular compuesta por dos membranas, la membrana plasmática y la membrana externa. Se han reportado cuatro vías de secreción de proteínas en bacterias gram-negativas, y tres de ellas están presentes en P. aeruginosa(72,75). En la secreción tipo I las exoproteinas pasan directamente al medio extracelular sin pasar por el espacio periplásmico. En la translocación por esta vía no participa el péptido señal, sino depende de la presencia de ciertas firmas de amino ácidos en la región carboxilo de las proteínas, así como del concurso de algunas proteínas accesorias específicas para la translocación del polipéptido a secretar. Los casos mejor estudiados de este tipo de secreción lo constituyen las proteasas de Erwinia chrysanthemi y la α-hemolisina de E. coli. En P. aeruginosa la proteasa alcalina codificada por el gen aprA se secreta por esta vía; participan en su secreción las proteinas AprD, AprE, y AprF(75). La vía de secreción tipo II, también llamada vía de secreción general, es la responsable de la secreción de la mayoría de las proteinas extracelulares en bacterias gram-negativas, aunque E. coli y Salmonella no la presentan. En esta ruta, la secreción a través de la membrana interna depende del sistema Sec, presente en bacterias gram positivas y gram negativas, y del péptido señal en el extremo amino de las proteínas que se translocan. Una vez en el espacio periplásmico, las proteínas se translocan por un conjunto de 12 a 14 proteínas, que en P. aeruginosa se denominan Xcp(75)(Animación 4).Las proteínas que se transportan por el sistema Xcp en P. aeruginosa son, entre otras, la elastasa, la lipasa, la exotoxina A, las fosfolipasas y la fosfatasa alcalina. Como mencioné antes, la transcripción de los genes que codifican para varias de las proteínas que se secretan por esta vía está regulada por el sistema "sensor de quorum" que adicionalmente regula a los genes xcp(9). El sistema de secreción tipo III transloca las proteinas directamente de la bacteria a la célula eucariote, por lo que se encuentra presente en bacterias patógenas de plantas o animales. En P. aeruginosa varias exotoxinas se translocan a las células eucariotes mediante este sistema tipo III(21).Entre estas toxinas se encuentran las exotoxinas S y T que bloquean la transducción de señales de la célula infectada mediante su actividad de ADP-ribosil-transferasa, así como la exotoxina Y, descrita recientemente, que eleva el Amp cíclico, pues tiene actividad de adenilato ciclasa. Las proteínas que intervienen en el tipo de secreción III tienen homología estructural con proteinas que intervienen en el ensamble del flagelo(21). Producción de Biosurfactante Un surfactante es un compuesto tenso-activo, esto es, que tiene propiedades detergentes. El hombre usa una enorme cantidad de surfactantes sintetizados químicamente en los diversos productos de limpieza que consumimos. Muchísimos seres vivos producen surfactantes para distintos fines, y a estos compuestos se le llama biosurfactantes(23).Los biosurfactantes son importantes, por ejemplo, en nuestros pulmones en donde se produce un surfactante que es fundamental en el intercambio de gases. La bacteria Serratia liquefasciens produce un surfactante que le permite a las células desplazarse en una superficie(20),mientras que el autoinductor de Bacillus subtilis es un biosurfactante llamado surfactina(21).La naturaleza química de los biosurfactantes es muy variada, hay péptidos polisacáridos y glicolípidos, entre otros. Los biosurfactantes tienen un gran potencial biotecnológico ya que son tan efectivos o más que los sintetizados químicamente, pero son totalmente biodegradables y no son tóxicos (23). P. aeruginosa produce el biosurfactante ramnolípido como parte de la respuesta dependiente del sensor de quorum RhlR(52).En las condiciones de laboratorio esta bacteria produce dos formas de este glicolípido, una contiene una molécula de ramnosa y la otra tiene dos(Figura 16).No es claro el papel que los ramnolípidos tienen para P. aeruginosa, se ha postulado, por ejemplo, que P. aeruginosa usa estos biosurfactantes para solubilizar sustratos hidrofóbicos como el hexadecano(52),sin embargo muchos aislamientos no usan hexadecano como fuente de carbono y todas las cepas producen ramnolípidos. Otras posibilidades serían que estos biosurfactantes participaran en motilidad celular, en la resistencia natural de la bacteria a metales, o como señales de deprivación de nutrimentos dentro de la respuesta sensora de quorum. Las aplicaciones biotecnológicas de los ramnolípidos son múltiples(42),pero su principal utilidad es la limpieza de suelos contaminados con hidrocarburos(42)o con metales pesados(45)(Fig. 12 y13).Recientemente se reportó que los ramnolípidos pueden matar en bajas concentraciones a hongos zoospóricos(Animación 5 yFig. 14,15 y16)(70),que son importantes patógenos de plantas comerciales, de modo que también tienen un potencial en el control biológico de estas plagas. Dentro de mi laboratorio del Instituto de Biotecnología de la UNAM, hemos reportado la descripción de la vía metabólica que interviene en la síntesis de los ramnolípidos(42)(Animación 6).Conocer esta vía nos ha permitido establecer una estrategia para producir ramnolípidos en cepas recombinantes de E. coli(Animación 7).La ventaja de producir ramnolípidos en esta enterobacteria es que la producción de metabolitos por P. aeruginosa a nivel industrial está restingida por tratarse de un patógeno oportunista. Producción de Polihidroxialcanoatos P. aeruginosa almacena como reserva de carbono, en condiciones de limitación de nitrógeno, polihidroxialcanoatos (PHA) de 10 a 14 carbonos y, una vez que la bacteria se encuentra en un medio propicio, se degradan mediante la β-oxidación(75). En el laboratorio a mi cargo encontramos que gran parte de los PHA se sintetizan mediante una ramificación de la vía general de la biosíntesis de ácidos grasos, a nivel de la enzima β-cetoacil reductasa (FabG). Tanto los monómeros de PHA como la parte lipídica de los ramnolípidos son sintentizados en su mayor parte por la vía general de síntesis de ácidos grasos, sin embargo a partir de la reducción del intermediario cetoacilo-ACP, existe una enzima (RhlG, Animación 6)que es específica para la síntesis de PHA y ramnolípidos(4).De este modo, las mutantes en el gen rhlG producen niveles muy bajos de PHA(Fig. 17 y18)y no producen ramnolípidos(4). Los PHA tienen una amplia aplicación biotecnológica ya que a partir de ellos se pueden producir plásticos biodegradables. Degradación de Alcanos de Cadena Ramificada Algunos hidrocarburos se acumulan en el medio ambiente debido a su baja biodegradabilidad. Este es el caso de los alcanos y alquenos de cadena ramificada, especialmente aquellos con terminaciones en tres metilos o con carbonos cuaternarios(65).Se han reportado cepas de P. aeruginosa que tienen la capacidad de degradar este tipo de compuestos y que, por tanto, son útiles en la limpieza de sitios contaminados con estos compuestos(65). El surfactante de más amplio uso en países subdesarrollados es el alquilbenceno sulfonato de cadena ramificada (ABSr), este detergente representa un problema de contaminación muy serio, ya que se acumula en ríos y lagos debido a la baja tasa de degradación de su cadena lateral. En el laboratorio a mi cargo aislamos de una planta de tratamiento de aguas domesticas e industriales una cepa de P. aeruginosa (W51D) capaz de degradar el ABSr(68).La cepa tipo PAO1 no es capaz de degradar el detergente, sin embargo sí degrada el alqueno ramificado citronelol(6)(Fig. 19),que ha sido usado como modelo para estudiar la vía de degradación de hidrocarburos ramificados. La vía de degradación del ABSr en la cepa W51D muestra que este detergente se degrada en parte por la ruta de degradación del citronelol, que está presente en distintas cepas de P. aeruginosa, pero que la mayor parte del surfactante se degrada por una nueva vía catabólica(5).En esta nueva vía el primer paso es la desulfonación del surfactante, y posteriormente se degrada completamente la cadena lateral hasta ácido benzoico, para finalmente romper el anillo aromático y ser degradado por el ciclo de los ácidos tricarboxílicos(Animación 8). El grupo de investigación coordinado por el Maestro Oscar Monroy de la Universidad Metropolitana ha demostrado la utilidad de la cepa W51D en el tratamiento de aguas residuales con un alto contenido de surfactantes del tipo de los alquil bencenos lineales. Como se trata de un tratamiento anerobio, las bacterias no sobreviven más que en los primeros reactores, evitandose así los problemas de liberar al medio ambiente grandes cantidades de un patógeno potencial. Algunas Consideraciones Evolutivas Como hemos visto, P. aeruginosa tiene una extraordinaria capacidad para adaptarse a diversos ambientes y tiene, además, la particularidad de no presentar una población clonal. Esto es, la población de estas bacterias comparte una gran parte de su genoma a través de mecanismos de recombinación. Estas características plantean una serie de interrogantes acerca de la manera en que esta bacteria ha evolucionado. Uno puede cuestionarse cómo se seleccionan los elementos que participan en la patogenia de P. aeruginosa. Surgen algunas preguntas como: ¿Cómo pueden seleccionarse en el medio ambiente las proteínas que son específicas para la infección de células eucariotes? Tal es el caso del sistema de secreción de proteínas tipo III, las exotoxinas A, T, Y y S y las elastasas. ¿Cuál es la presión de selección que determina que todas las cepas de P. aeruginosa presenten un sistema regulatorio tan complejo como el sensor de quorum, encargado fundamentalmente de regular la expresión de los elementos involucrados en la virulencia de la bacteria? ¿Acaso la respuesta sensora de quorum representa alguna ventaja selectiva para P. aeruginosa viviendo en el medio ambiente? Para ejemplificar esta problemática mencionaré el caso de la cepa IGB83 de P. aeruginosa, que aislamos a partir de un coco recolectado en la selva chiapaneca(55).Esta cepa presenta una elevadísima producción de enzimas hidrolíticas y otros factores de virulencia como son los ramnolípidos y la piocianina, regulados por la respuesta sensora de quorum. Es más, la virulencia de la cepa IGB83, a pesar de ser un aislamiento ambiental, es mucho mayor que la de algunos aislamientos clínicos, como la cepa tipo PAO1. Por otra parte, es también difícil entender cómo pueden conservarse las secuencias especie específicas mediante la recombinación entre cepas aisladas de sitios distantes geograficamente y de ambientes con características totalmente distintas. Si se analiza, por ejemplo, la secuencia de algunas regiones del genoma de las cepas IGB83 y PAO1 que no codifican para genes esenciales, como el gen que codifica para la lipasa LipA y su región regulatoria, encontramos que tienen un 99% de identidad, aún en la región no codificante. Asimismo, si comparamos la secuencia del gen motR, rhlG o de los genes rhl, que partcipan en la producción de ramnolípidos, entre las cepas PAO1, el aislamiento ambiental PG201 y la cepa IGB83, encontramos que en todos los casos las secuencias presentan más de un 90% de identidad. Es también importante entender cuáles son los mecanismos que determinan los límites para la recombinación genética en P. aeruginosa y cuáles son los mecanismos moleculares que intervienen en el proceso de recombinación. Preguntarnos, por ejemplo: ¿Cómo se reconocen entre sí las cepas de P. aeruginosa? ¿Existe un proceso de recombinación con bacterias cercanamente relacionadas como P. fluorescens o P. putida? La información específica de cada clona pareciera no tener un papel importante en la evolución de esta bacteria, sino más bien tratarse de información accesoria con una importancia coyuntural en determinado nicho ecológico. Esta conclusión puede obtenerse, precisamente, a partir de la falta de conservación de estas secuencias entre los aislamientos de P. aeruginosa, así como de su falta de coevolución con genes esenciales de la bacteria como aquellos que codifican para el RNA ribosomal. El papel de la información específica de cada clona pareciera ser análogo al que juegan los plásmidos en otras bacterias. P. aeruginosa es pues, una bacteria que coloniza exitosamente una enorme diversidad de nichos, y que mantiene una población con una secuencia genómica común mediante la recombinación. Estas caracteristicas poblacionales nos llevan a cuestionar el papel que tienen algunos principios de la teoría de la evolución darwiniana sobre la evolución de esta bacteria. ¿Cómo podemos explicar el cambio evolutivo de esta bacteria mediante el criterio de selección del más apto, si la recombinación genética no permite definir a una clona o individuo?¿Se puede hablar de deriva génica en una población en la que no hay barreras geográficas? Esto es, si los cambios evolutivos se dan cuando, por medio de la selección natural, se selecciona al individuo que tiene una mayor capacidad reproductiva en un determinado nicho ecológico ¿cómo se fijaría un cambio genético, si la información se comparte por toda la población? Sin duda el estudio de la genética molecular de P. aeruginosa nos permitirá en el futuro cercano contestar algunas de estas preguntas y formular otras, como parte del maravilloso e interminable quehacer científico, de modo que vaya creciendo nuestro entendimiento de este, sin duda extraodinario y temido organismo.
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