Susana López y Carlos F. Arias

Departamento de Genética y Fisiología Molecular, Instituto de Biotecnología. Universidad Nacional Autónoma de México.

Generalidades

Las gastroenteritis infecciosas agudas son la causa más frecuente de morbilidad y mortalidad en niños menores de cinco años en los países en desarrollo, con alrededor de mil millones de episodios diarréicos y entre cuatro y cinco millones de muertes por año. Los rotavirus son la causa principal de las diarreas deshidratantes severas en niños menores de dos años, y se ha estimado que una vacuna efectiva contra estos virus podría evitar cerca de 800,000 muertes de infantes cada año (25, 29, 48). Es importante hacer notar que aunque la mortalidad debida a las infecciones por rotavirus es mucho mayor en países en desarrollo que en países desarrollados, la frecuencia de infección es muy similar en ambos tipos de países. Debido al papel tan importante que tienen los rotavirus en las enfermedades diarréicas infantiles, y al hecho de que aún niveles de higiene avanzados parecen no ser capaces de controlar significativamente las infecciones por estos virus, existe un interés considerable en desarrollar estrategias de vacunación que sean eficaces para controlar la severidad de la diarrea causada por estos virus (48).

Los rotavirus en humanos fueron inicialmente descritos en 1973 por Ruth Bishop y colaboradores en Australia (10), quienes encontraron la presencia de partículas virales al observar al microscopio electrónico biopsias de intestino delgado de niños que tenían diarrea severa de origen no bacteriano. En base a la morfología de estos virus, cuya apariencia al microscopio electrónico era la de una rueda de carreta antigua, estos virus fueron bautizados con el nombre de rotavirus, del latín rota, que quiere decir rueda (35) (Figura 1). Desde entonces, estos virus han sido reconocidos como el principal agente etiológico de las gastroenteritis virales en las crías de un gran número de mamíferos (incluyendo al hombre), y de aves (30), y también se ha generado una gran cantidad de información sobre las propiedades biológicas y epidemiológicas de estos virus.

La infección por rotavirus es muy común, se ha observado que a la edad de 5 años, el 95% de los niños ya han sido infectados. El pico de incidencia de la enfermedad es en los niños de entre 6 y 24 meses de edad, siendo esta, la población con más alto riesgo de sufrir una diarrea severa, que frecuentemente requiere de hospitalización. La infección en adultos es por lo regular asintomática, aunque ocasionalmente se presentan los síntomas en los padres de niños infectados, en pacientes inmunocomprometidos, y en adultos de la tercera edad. La diarrea por rotavirus ocurre principalmente durante los meses de otoño e invierno en los países de climas temperados; esta estacionalidad es menos marcada en los países con clima tropical (22). La sintomatología típica de la infección por rotavirus es diarrea severa (más de 8 evacuaciones al día) acompañada de vomito y puede, o no, cursar con fiebre (37.80C-390C). Esta es una enfermedad autolimitada, con una duración promedio de aproximadamente cinco días. La gran mortalidad asociada a esta enfermedad es debida a la severa deshidratación que provoca la infección, por lo que la recomendación principal en este padecimiento es la de rehidratar y mantener el balance electrolítico del paciente (48). Las manifestaciones clínicas de la infección por rotavirus no son lo suficientemente características para permitir un diagnóstico inequívoco basándose en éstas, por los que se requiere de la detección directa del virus, o del antígeno viral para tener el diagnostico preciso. Durante la infección los rotavirus se excretan en grandes cantidades durante los episodios diarréicos, por lo que se pueden detectar fácilmente por inmunoensayos o por electroforesis del genoma viral (48), como veremos más adelante.

La principal ruta de transmisión de los rotavirus es la vía fecal-oral, aunque también se ha especulado que el contacto persona a persona, el contacto con secreciones respiratorias, y/o el contacto con superficies contaminadas pudieran ser fuentes de transmisión, ya que los altos índices de infección por este virus en los primeros tres años de vida en todo el mundo son independientes de las condiciones higiénicas y sanitarias. La infección es especie-específica ya que la transmisión de rotavirus entre el hombre y animales no ha sido documentada, a pesar de que las cepas aisladas de humanos tienen una alta homología genética con las cepas aisladas de animales (71).

Existen varios grupos de rotavirus, dependiendo de sus características antigénicas; hasta ahora, se han descrito seis grupos (A, a F) de rotavirus, que difieren también en sus características epidemiológicas, la especie animal donde más frecuentemente se encuentran y el grupo de edad en la que son más prevalentes. Los grupos A, B y C se han encontrado tanto en animales como en humanos, y los rotavirus de los grupos D, E y F sólo se han aislado de especies animales (32, 77). En este capítulo nos referiremos exclusivamente a los rotavirus pertenecientes al grupo A, ya que además de que fueron los primeros en descubrirse, y de los que más conocemos, representan el principal grupo de importancia médica y veterinaria. Los rotavirus del grupo A se clasifican, además, en diferentes serotipos y genotipos basándose en las características de las proteínas VP4 y VP7, las cuales forman la capa externa del virus. Hasta ahora los rotavirus se han clasificado en 14 serotipos-G en base a la glicoproteína VP7 y en 11 serotipos-P en base a la proteína VP4 (48).

Inicialmente resultó más fácil adaptar a crecer en cultivo de tejidos a varios tipos de rotavirus aislados de animales, a diferencia de los rotavirus aislados de humanos que resultaron ser difíciles de adaptar, por lo que el conocimiento de la bioquímica y la biología molecular de los rotavirus aislados de animales avanzó mucho más rápidamente (29). Sin embargo, los conocimientos que hemos adquirido en estas áreas estudiando a los rotavirus aislados de especies animales se han podido extrapolar, en general, a los rotavirus aislados de humanos. Dentro de las cepas de rotavirus más estudiadas se encuentran dos cepas provenientes de simio; el rotavirus SA11 (Simian Agent-11), aislado de un mono verde africano y el rotavirus RRV (rhesus rotavirus), aislado de un mono rhesus. La mayoría de la información que se aportará en este capítulo se refiere a datos obtenidos al estudiar principalmente estas dos cepas, aunque como ya mencionamos, toda esta información es extrapolable, en lo general, a la gran mayoría de las cepas de rotavirus del grupo A, independientemente del origen del huésped del que se hayan aislado.

Los rotavirus pertenecen a la familia Reoviridae. Los miembros de esta familia de virus presentan las siguientes características comunes: i) Las partículas virales tienen una geometría icosahédrica, ii) no están envueltos por una membrana lipídica; iii) tienen un genoma compuesto por segmentos de ARN de doble cadena; iv) el ARN genómico no es infeccioso per se en ausencia de las proteínas virales; v) la partícula viral contiene todas las enzimas necesarias para la producción de sus ARNs mensajeros; y vi) la replicación viral se lleva a cabo exclusivamente en el citoplasma de la célula (29).

Estructura de la particula viral

Estudios realizados recientemente, utilizando criomicroscopía electrónica y reconstrucción de imágenes, han permitido realizar análisis detallados de las características estructurales de la partícula viral ó virión, con una resolución de aproximadamente 26 Å (83, 85, 91, 100). Las partículas virales tienen aproximadamente 75 nm de diámetro, con una geometría icosahedríca con simetría de T=13l. El virión maduro está compuesto por tres capas concéntricas de proteína que engloban al genoma viral (84). La capa externa del virión esta formada por 780 moléculas de la glicoproteína VP7. De esta capa lisa (en color azul en la animación 1) se proyectan 60 espículas de ~12 nm de longitud constituidas por dímeros de la proteína VP4 (en color verde) (83); la base de éstos dímeros de VP4 interacciona con la capa intermedia del virión. Esta capa intermeda, de aproximadamente 10 nm de grosor, consta de 260 unidades morfológicas constituidas por trímeros de la proteína VP6 (en color rojo), esta proteína es la más abundante del virus, constituyendo aproximadamente el 50% de la proteína total del virión. La capa intermedia, a su vez, rodea a la capa más interna del virión o nucleocápside, que está formada por 60 dímeros de la proteína VP2 (55) (en color gris), la cual engloba al genoma viral. Una copia de la proteína VP1 y una de VP3 (en colores azul agua y amarillo, respectivamente) están asociadas con la cara interna de la capa de VP2 (en mosaico morado y verde), y localizadas en los doce vértices del icosahedro, donde se ha propuesto que llevan a cabo su función de replicar y modificar los genes del virus (55, 86). También dentro de esta nucleocápside se encuentran los once segmentos de ARN de doble cadena (ARNdc) que constituyen el genoma del virus. Los estudios de criomicroscopía electrónica han revelado que estos segmentos de ARN parecen estar también ordenados geométricamente dentro de la partícula (86), y se ha propuesto que de los aproximadamente 18,500 pares de bases (pb) que constituyen al genoma viral, cerca de 4,500 pb están organizados con una simetría que parece depender del ensamble icosahédrico de VP2, la cual al hacer contacto con los segmentos de ARN, induce en estos su organización (en color azul metálico). Tomando en conjunto todas estas observaciones, se ha sugerido que las proteínas VP1, VP2 y VP3 están involucradas en la organización del genoma dentro de la nucleocápside mediante interacciones ARN-proteína (55, 84).

La existencia de cada una de las capas proteícas del virus, así como las interacciones que existen entre VP7 y VP4, y de estas proteínas con VP6, han sido corroboradas mediante la producción de pseudo-partículas virales, a través de la co-expresión de los genes que codifican para cada una de estas proteínas (VP2, VP6, VP4 y VP7), en sistemas de expresión heterólogos, como el sistema de células de insecto infectadas con baculovirus recombinantes (15, 16, 102). Estos experimentos también han demostrado que las proteínas virales tienen la habilidad intrínseca de auto-ensamblarse.

Por criomicroscopía electrónica se ha observado que la partícula viral completa contiene 132 canales acuosos, que han sido clasificados en tres grupos (I, II y III) dependiendo de sus características de simetría y tamaño. Estos canales atraviesan a la partícula viral desde la capa externa hasta la nucleocápside. Aún no es claro el papel que juegan estos canales durante el ciclo de replicación del virus, sin embargo se ha propuesto que podrían estar involucrados en la entrada de los metabolitos necesarios para la transcripción del ARN dentro de la partícula de doble capa, así como de la salida de los transcritos virales (32, 55). De hecho, recientemente al observar por criomicroscopía electrónica partículas virales activas en el proceso de transcripción, se ha encontrado que los ARN mensajeros (ARNm) virales salen de la partícula a través de los canales tipo I, que se encuentran localizados en los 12 vértices de la partícula icosahédrica, en los que también se localizan las proteínas VP1 y VP3 (55).

Características fisicoquímicas y funcionales de la particula viral

Existen tres tipos de partículas virales con diferentes características estructurales y funcionales: i) la partícula completa, que contiene las tres capas proteicas, es también llamada TLP (Triple-Layered Particle); esta es la partícula infecciosa ya que la presencia de la capa externa formada por las proteínas VP4 y VP7 le permite unirse y penetrar a su célula huésped (como veremos más adelante); ii) la partícula que contiene dos capas proteicas o DLP (Doble-Layered Particle); esta particula no es infecciosa, pero es transcripcionalmente activa. El tratamiento de las TLPs con agentes quelantes del ión calcio, tales como EDTA o EGTA, provoca que la VP4 y la VP7 se desprendan de la partícula viral, generándose así las DLPs que tienen la capacidad de sintetizar los ARN mensajeros virales; y por último, iii) las partículas que contienen una sola capa de proteínas, o nucleocápsides, que tienen la actividad de replicar al genoma viral. Estas partículas se pueden generar in vitro, mediante el tratamiento de las DLPs con agentes tales como tiocianato de sodio, o altas concentraciones de calcio (21). La figura 2 muestra estos tres tipos de partículas y su actividad.

Además de tener diferentes actividades biológicas, estas partículas tienen diferentes propiedades fisicoquímicas. Entre estas vale la pena mencionar el hecho de que tienen diferentes densidades, lo que nos permite separarlas mediante gradientes de cloruro de cesio. Las TLPs tienen una densidad de 1.36 g/cm3, las DLPs de 1.38 g/cm3 y las nucleocápsides de 1.44 g/cm3 (9). También, dada su diferencia en tamaño, estos tres tipos de partículas pueden ser separadas mediante electroforesis en geles de agarosa (40).

Las partículas de rotavirus son relativamente estables. Las partículas virales son funcionales en un rango de pH de 3 a 9, y el virus es estable por meses a 40C, y aún a 200C cuando se mantiene en 1.5mM de calcio (33). La partícula completa mantiene su integridad y su infectividad cuando es tratada con solventes orgánicos tales como éter, cloroformo o freón, lo que refleja la ausencia de lípidos en su estructura . Pero pierde su infectividad al ser tratada con desinfectantes tales como formalina, cloro, betapropiolactona y etanol al 95%, quizás por la perdida de la capa externa (8, 52, 96).

Genoma

El genoma de los rotavirus está constituido por once segmentos de ARN de doble cadena, (ARNdc) cuyos tamaños varían de aproximadamente 660 pb del gen más pequeño, hasta aproximadamente 3300 pb para el gen más grande (11, 64). Esta diferencia de tamaños permite que estos segmentos al ser separados electroforéticamente presenten un patrón característico, típico y único para los rotavirus, lo que ha sido la base para desarrollar un método diagnóstico para estos virus. En general el patrón electroforético, o electroferotipo, consiste de un grupo de cuatro segmentos de ARN (1-4) de alto peso molecular; 5 segmentos de tamaño mediano (5 a 9) que incluyen un triplete muy característico formado por los segmentos 7, 8 y 9; y los dos segmentos más pequeños (10 y 11) (Figura 3).

Como ya se ha mencionado, el genoma viral desnudo (en ausencia de las proteínas de la cápside) no es infeccioso, ya que para transcribirse, este genoma necesita de una ARN polimerasa que pueda utilizar ARN como molde. Esta polimerasa no se encuentra en las células, por lo que el virus debe de proveer esta actividad para garantizar su replicación.

Los ARN mensajeros (ARNm) de rotavirus contienen la estructura de CAP en su extremo 5', pero a diferencia de la mayoría de los ARNm celulares, no tienen poli(A) en su extremo 3' (44, 65). En general, la secuencia nucleotídica de los genes virales es rica en A/T (58-67%). Cada segmento de ARN codifica por una proteína viral, excepto el gen 11 el cual contiene dos marcos abiertos de lectura, los cuales codifican dos proteínas virales. En la mayoría de los casos la traducción de los ARNm comienza en el primer codon de inicio que tiene las características del consenso de Kozak (51).

Actualmente, conocemos la secuencia nucleotídica de los once segmentos de ARN de varias cepas de rotavirus. El análisis comparativo de estas secuencias ha revelado que existen varias características compartidas entre todos los segmentos. La figura 4 muestra un esquema que ilustra estas características comunes: Todos los genes de rotavirus están flanqueados en los extremos 5' y 3' por secuencias no traducidas; la longitud de estas secuencias es variable entre los diferentes genes (entre 9 y 49 nucleótidos en el extremo 5' y entre 17 y 182 nucleótidos en el extremo 3'), pero se conserva entre los segmentos equivalentes de cepas aisladas de diferentes especies. Estas secuencias no traducidas flanquean un marco abierto de lectura en todos los segmentos, a excepción del segmento 11 que contiene dos marcos abiertos de lectura. Los primeros 10 nucleótidos del extremo 5', así como los últimos 8 nucleótidos del extremo 3' están altamente conservados entre todos los segmentos de las diferentes cepas; las secuencias consenso de estas regiones son : 5' (GGC A/U A/U UA/U A A/U A/U.....) y en el extremo 3': (….A/U U G/U U/G G/U A/G CC) (30, 73). La alta conservación de estas secuencias consenso entre los diferentes segmentos sugiere que estas regiones contienen señales que son importantes para la transcripción, transporte, replicación y/o ensamblaje de los segmentos virales. Cada partícula viral contiene exactamente 11 segmentos de ARN de doble cadena, lo que indica que la replicación y el empaquetamiento de las 11 especies de mensajeros debe de ser un proceso altamente coordinado.

Como mencionamos anteriormente, el genoma de estos virus se puede rearreglar, esto es que cuando una célula es coinfectada por dos cepas distintas de rotavirus, la progenie viral resultante de esta co-infección es una población de virus que contiene diferentes combinaciones de los diferentes genes parentales. La animación 2 ilustra una analogía a este proceso de rearreglo génico comparándolo con un juego de barajas. Este tipo de rearreglos génicos entre rotavirus de diferentes cepas es posible gracias a las secuencias consenso que comparten todos los segmentos del genoma viral y es una fuente de variabilidad génica de esta familia de virus.

También, recientemente se ha reportado que en las regiones no traducidas de los mensajeros de los rotavirus existen señales de replicación que actúan en cis. Entre estas, se ha definido una señal promotora mínima, esencial para la síntesis de la hebra negativa de ARN (que es la hebra de ARN complementaria al mensajero o hebra positiva) durante la replicación del genoma, la cual esta formada por los últimos siete nucleótidos del extremo 3'. Se han identificado otras dos regiones adicionales, que funcionan como reguladores positivos, ya que en presencia de estas secuencias se obtiene un nivel optimo de síntesis de los ARNm virales; estas secuencias consisten de aproximadamente 25 nucleótidos, inmediatamente "río arriba" de la región promotora del extremo 3' y de al menos 10 nucleótidos en el extremo 5' del ARNm (97, 98).

Asignamiento génico

Que proteína es codificada por cada segmento de ARN viral? Esta pregunta se abordó inicialmente mediante la traducción in vitro de cada uno de los ARN mensajeros virales y/o analizando las proteínas producidas por virus rearreglados provenientes de coinfecciones con dos cepas de virus diferentes. Los primeros asignamientos génicos completos se llevaron a cabo con el rotavirus de simio SA11 (2, 12).

En la en la tabla 1 se muestra este asignamiento. Las proteínas estructurales del virus, es decir aquellas que conforman la partícula viral, se denominan con el prefijo VP (Viral Protein). Seis de los genes virales, los genes 1, 2, 3, 4, 6, y 9 codifican por las proteínas VP1, VP2, VP3, VP4, VP6 y VP7, respectivamente. Los 5 genes restantes (segmentos 5,7,8,10 y 11) codifican por las seis proteínas no estructurales, las que se denominan con el prefijo NSP (Non Structural Protein). Estas proteínas, que no forman parte del virión, se sintetizan en la célula durante el ciclo replicativo del virus y tienen funciones que discutiremos más adelante.

Algunas de las proteínas virales sufren modificaciones post traduccionales, tales como glicosilación, fosforilación, o cortes proteolíticos. Estas modificaciones alteran el peso molecular aparente de las proteínas, por lo que los pesos moleculares que se pueden predecir en base al número de aminoácidos que contiene cada proteína, no correlaciona en algunos casos con el peso molecular observado para una proteína dada.

Proteínas estructurales

Proteínas de la nucleocápside

Las proteínas que conforman la nucleocápside son VP1, VP2 y VP3. Como ya mencionamos, es en estas partículas donde se lleva a cabo la replicación del ARN viral. La actividad responsable de esta función, la ARN polimerasa dependiente de ARN, forma complejos con otras proteínas virales. Las proteínas que constituyen los complejos varían, dependiendo de si la función del complejo es la de sintetizar ARN de doble cadena utilizando como templado el ARNm (partículas replicativas), o si se trata de sintetizar ARN mensajeros a partir del ARN de doble cadena (partículas activas en transcripción).

Recientemente se implementó un sistema libre de células para estudiar la replicación del genoma viral. Este sistema, que consiste en nucleocápsides que han sido "abiertas" por exposición a bajas concentraciones de sales a las cuales se les añade ARNm viral, para que sea transformado en dcARN, ha sido bien caracterizado y ha sido utilizado para definir el papel de cada una de las proteínas involucradas, así como las regiones en los ARNm que son necesarias para que estos puedan ser replicados (17). También se ha implementado un sistema similar partiendo de la coexpresión de las proteínas virales (VP1, VP2 y VP3) en células de insecto. Estas tres proteínas se ensamblan de manera espontánea, y tienen actividad de replicasa si se les añade ARNm viral. Esto ha permitido determinar de manera más fina la importancia de cada una de las proteínas en la replicación del ARN. En estos sistemas se ha observado que el ARNm funciona eficientemente como templado para la síntesis del ARNdc, sin embargo, el ARNdc viral no sirve como templado para la síntesis de ARNm, lo que es consistente con la observación de que los requerimientos estructurales, o las proteínas requeridas para la transcripción (síntesis del ARNm) son diferentes de los requerimientos para la replicación (síntesis de la cadena complementaria del ARNm). Los estudios realizados en este sistema de replicación, han demostrado que VP2, y no VP6, es esencial para la actividad de replicasa de la partícula (63). Estos resultados indican también que las partículas que forman la nucleocápside, o un subgrupo de estas proteínas, tienen la función tanto de replicasas, como de transcriptasas.

VP1. A pesar de que aún no existe evidencia directa para afirmar cual de las proteínas virales de la nucleocápside es la ARN polimerasa dependiente de ARN, la proteína VP1 (de 1088 aminoácidos), producto del gen 1 es la más probable, por las siguientes razones: i) La secuencia de la proteína contiene regiones que tienen homología con motivos conservados entre la ARN polimerasas dependientes de ARN de otros virus (20, 37, 69); ii) VP1 está presente en partículas virales transcripcionalmente activas, y se puede entrecruzar con el ARNm, utilizando luz ultravioleta como agente entrecruzador (76); iii) VP1 es componente común de las partículas virales con actividad de ARN polimerasa (transcriptasa o replicasa) (40). Además los complejos de VP1-VP2 coexpresados en células de insecto tienen la propiedad de sintetizar ARNdc in vitro a partir de ARNm viral (103).

VP2. El producto del gen 2, VP2, de 881 aminoácidos, es la proteína más abundante de la nucleocápside, y constituye la capa más interna del virus. Cuando esta proteína se expresa por si sola con el sistema de baculovirus se ensambla en partículas similares a las nucleocápsides, lo que sugiere que VP2 no depende de otros productos virales (ARNs o proteínas) para formar este tipo de partículas (54). VP2 es capaz de unirse a ARNs de cadena sencilla o doble, aunque tiene una mayor afinidad por los ARNs de cadena sencilla, función que podría estar relacionada con el empaquetamiento de los ARNs virales dentro de la nucleocápside (53). En experimentos de reconstitución utilizando proteínas purificadas, se ha encontrado que aunque muy probablemente VP1 es la ARN polimerasa viral, esta requiere de VP2 para realizar su función (63).

VP3. Esta proteína, de 835 aminoácidos, es codificada por el segmento de ARN 3, es una proteína básica, y al igual que VP1 existen muy pocas copias de este polipéptido por virión. A VP3 se le ha atribuido la actividad de guanilil-transferasa del ARN viral por las siguientes observaciones (56, 74, 79): i) Tiene una alta afinidad por ARN de cadena sencilla y no se une al ARN de doble cadena (74); ii) su secuencia contiene motivos estructurales que se han encontrado en otras guanilil transferasas(37, 69); iii) une GTP de modo covalente en una reacción reversible. Dado que esta actividad es necesaria para la síntesis de los ARNs maduros, pero no para los ARNdc, VP3 debe de ser un componente esencial de los complejos de transcripción y no de los complejos replicativos. De hecho, como ya mencionamos, los complejos de VP1-VP2 producidos en el sistema de baculovirus recombinante, son capaces de replicar ARNm (97).

Proteína de la capa intermedia

La capa intermedia del virus esta formada por la proteína más abundante del virión, VP6, codificada por el gen 6. Esta proteína, de 397 aminoácidos, juega un papel muy importante en la estructura del virión dado que interacciona tanto con la proteína VP2, hacia el interior de la partícula, como con VP4 y VP7 en la capa externa del virión (85). VP6 forma espontáneamente trímeros y es muy estable; esta característica y el hecho de que contiene determinantes antigénicos (o epítopes) conservados entre diferentes cepas de rotavirus, son la razón de que VP6 sea el blanco antigénico principal en los ensayos de diagnostico inmunológico para los rotavirus. Los epítopes de VP6 que son conservados entre todas las cepas de rotavirus del grupo A son llamados epítopes de grupo. En esta proteína también se han identificado otros epítopes, llamados epítopes de subgrupo, los cuales han sido utilizados como marcadores epidemiológicos para clasificar diferentes cepas dentro del grupo A.

Como ya mencionamos anteriormente, si se remueve VP6 de las DLPs se pierde la actividad de transcriptasa de esta partícula, aunque hasta la fecha no se ha reportado que esta proteína tenga este tipo de actividad. Aparentemente el papel de VP6 en esta función es principalmente estructural, a través de mantener la conformación apropiada, o la organización del complejo transcripcional en la nucleocápside viral (9, 90). Recientemente se resolvió la estructura cristalográfica de esta proteína. Sabemos que la unidad estructural de VP6 es un trímero, y que en este trímero existen un sitio de unión al ion calcio, y un sitio de unión al ion zinc, aunque aún no es claro cual es la función de estos iones en la partícula viral (Rey F. comunicación personal). Esta proteína es hidrofóbica y altamente antigénica e inmunogénica (31, 41, 89).

Proteínas de la capa externa

La capa más externa del virus esta formada por las proteínas VP4 y VP7, que son las proteínas responsables de los primeros contactos con la célula huésped y por lo tanto tienen funciones que determinan la infectividad del virus, tales como la determinación del rango de huésped del virus, la unión y la penetración del virus a la célula, y es por esto que como mencionamos anteriormente, son las principales inductoras de anticuerpos neutralizantes.

VP7 es la segunda proteína más abundante en el virión y es codificada por el segmento de ARN 7, 8, o 9 dependiendo de la cepa de rotavirus que se analice; en el caso de la cepa de simio SA11 es el gen 9 quien codifica por esta proteína (2). Esta proteína es altamente inmunogénica y es muy buena inductora de anticuerpos neutralizantes, que son serotipo específicos; hasta ahora se han encontrado 14 serotipos diferentes basados en las caracteristicas antigénicas de esta proteína. VP7, de 326 aminoácidos, se modifica post-traduccionalmente por la adición de azúcares. Es una N-glicoproteína que contiene únicamente oligosacáridos del tipo de alta manosa, (2, 27, 46), lo que indica que VP7 no viaja del retículo endoplásmico (RE) al aparato de Golgi, donde normalmente los oligosacáridos del tipo de alta manosa son modificados para convertirlos en oligosacáridos complejos. Por estudios bioquímicos sabemos que VP7 es glicosilada cotraduccionalmente a medida que se inserta en el lumen del RE y la señal para esta inserción se encuentra contenida en el péptido señal presente en el extremo amino de VP7 (2, 12, 28, 46). La secuencia nucleotídica del gen para VP7 predice un marco abierto de lectura de 326 aminoácidos que inicia con una secuencia consenso de Kozak débil (51), sin embargo, 30 nucleótidos después se encuentra un segundo codon de inicio, en fase, con una secuencia de inicio fuerte. Ambos codones de inicio preceden regiones hidrofóbicas (llamadas H1 y H2), que tienen el potencial de funcionar como péptidos señal para dirigir la síntesis de VP7 al RE (82). Independientemente del sitio de inicio de la traducción, se sabe que el péptido señal es cortado de la proteína madura por la enzima señalasa, entre la alanina 50 y la glutamina 51 (92). La proteína VP7 es retenida en la membrana del RE, sin embargo no contiene la secuencia típica de retención en RE (KDEL) (70), lo que ha sido motivo de estudio para determinar la señal que le permite a esta proteína mantenerse como proteína residente en el RE y aparentemente los aminoácidos ITG, en las posiciones 9-11 de VP7 son los responsables (61). La proteína VP7 del rotavirus SA11 tiene un sólo sitio de glicosilación localizado entre los aminoácidos 69-71 (2). Además de la glicosilación, la maduración de VP7 depende de la formación de puentes disulfuro intramoleculares (94) y de la presencia de iones calcio, de hecho, se ha propuesto que esta proteína tiene un dominio de unión a calcio, conservado entre las diferentes cepas de rotavirus, que se localiza alrededor de la prolina 279 (39).

Aún no se ha determinado ninguna función en la que VP7 participe directamente durante las primeras interacciones del virus con su célula huésped. Sin embargo, VP7 puede afectar la expresión de diferentes fenotipos y las propiedades antigénicas de VP4. Esto probablemente es el resultado de la interacción íntima de VP4 y VP7 en la superficie del virión. El análisis de rotavirus con rearreglos génicos, cuyas proteínas de capa externa provienen de diferentes cepas parentales ha mostrado que la reactividad de anticuerpos monoclonales dirigidos contra VP4 puede aumentar o disminuir dependiendo de la proteína VP7 acompañante (18). También se ha observado que fenotipos, como la capacidad de formar placas, el tamaño de placa, y la especificidad de unión al receptor, que son características especificadas por VP4, son afectados por el fondo genético y dependen del origen parental de ambas proteínas de la capa externa (14, 67, 99).

VP4 es la otra proteína de capa externa y es codificada por el segmento de ARN 4. Esta proteína, de 776 aminoácidos tiene funciones esenciales en el ciclo de vida del virus, incluyendo la unión al receptor y la penetración a la célula. Por lo tanto, las propiedades de esta proteína son determinantes importantes del rango de huésped, virulencia, tropismo, e inducción de inmunidad protectora (29). Esta proteína tiene varios dominios funcionales (Figura 5), los cuales se discuten a continuación:

i) La infectividad de los rotavirus se incrementa, y muy probablemente depende, del tratamiento del virus con tripsina. Este tratamiento proteolítico resulta en el rompimiento específico de VP4 (776 aa) en dos polipéptidos de menor peso molecular, llamados VP8 (aa 1-131) y VP5 (aa 247 a 776) (3, 57). El corte de VP4 no afecta la unión a la célula, y mas bien ha sido asociado con la entrada del virus al citoplasma celular , por penetración directa (47, 88). El mecanismo por el cual el corte con tripsina activa la infectividad viral se desconoce aún, sin embargo, se ha propuesto que la penetración del virus puede ser iniciada por los extremos recién generados por el corte con tripsina o por un posible cambio conformacional de VP4 a consecuencia del corte con esta proteasa.

ii) Algunas cepas de rotavirus de origen animal tienen la capacidad de aglutinar eritrocitos, y esta aglutinación es mediada por la interacción de VP4 con el ácido siálico (AS) presente en la superficie de los eritrocitos. El dominio responsable de esta interacción se encuentra en el fragmento VP8 de VP4 (36), y más específicamente, las tirosinas en posiciones 155 y 188, y la serina en posición 190, juegan un papel esencial en esta interacción (45).

iii) VP4 contiene dos puentes disulfuro intramoleculares, uno entre las cisteínas 203 y 216 en VP8, y otro entre las cisteínas 318 y 380 en VP5 (75). El puente disulfuro en VP5 se encuentra conservado en todas las cepas de rotavirus, mientras el puente disulfuro en VP8 no se encuentra en la mayoría de las cepas de origen humano. La relevancia biológica de estos puentes no se ha demostrado aún.

iv) La proteína VP5 tiene la capacidad de unirse específicamente a la superficie de las células (101), y esta interacción se da con la integrina a2b1, a través de la secuencia DGE presente en la posición 308-310 de VP5 (23).

v) En VP5 existe una región hidrofóbica entre los aa 384 y 404, la cual comparte homología con el dominio de fusión de la proteína E1 de los virus Sindbis y Semliki (62). Esta región tiene la actividad de permeabilizar liposomas in vitro (26), sin embargo su funcionalidad in vivo aún no ha sido demostrada.

vi) La predicción de la estructura secundaria de VP4 supone que existe un dominio globular rico en β-hélices, que abarca aproximadamente el 60% amino terminal de la proteína, y un dominio rico en regiones de α-hélice que abarca el 40% restante de la proteína; una de estas regiones, de 63 aa, tiene motivos de héptadas repetidas que son típicas de las estructuras de "coiled-coil" (58) y se presume que esta región es importante para la dimerización de VP4, aunque a la fecha esto no ha sido corroborado.

Proteínas no estructurales

Las proteínas no estructurales de rotavirus, NSP1 a NSP6, son codificadas por los segmentos 5, 7,8,10 y 11, respectivamente. Como su nombre lo indica estas proteínas no forman parte de la estructura del virión. Son sintetizadas en el citoplasma de la célula durante la infección y tienen funciones relacionadas con el control de la síntesis de proteínas celulares y virales, con la replicación del genoma, con el empaquetamiento de los genes virales y con la maduración de la partícula viral en el interior de la célula, aunque aún no se define completamente el papel de cada una de ellas en estas funciones. En la próxima sección en la que hablaremos del ciclo replicativo del virus, se describirán los datos que a la fecha se conocen acerca de cada una de estas proteínas.

Ciclo replicativo

Los rotavirus inician su ciclo de infección uniéndose a un receptor localizado en la superficie de la célula. Después de la unión al receptor, los rotavirus penetran al interior de la célula y pierden la capa externa, con lo cual se activa la transcripción. Los ARNs recién sintetizados cumplen dos funciones: como ARNs mensajeros que dirigen la traducción de las proteínas del virus, y como templados para la síntesis de los ARNs complementarios para la replicación del genoma. La selección, el empaquetamiento, y la replicación de los segmentos del genoma, así como la morfogénesis de las particulas de doble capa (DLPs), se llevan a cabo en estructuras electrodensas denominadas viroplasmas, que están compuestos de grandes cantidades de ARN y proteínas virales. Una vez formadas, las DLPs abandonan el viroplasma, y adquieren la capa externa al gemar a través de la membrana del retículo endoplásmico modificada por proteínas virales, finalmente los viriones maduros son liberados de la célula por lisis (Figura 6). Todo el ciclo replicativo de los rotavirus se lleva a cabo en el citoplasma celular, sin necesitar el núcleo de la célula.

Los pasos del ciclo replicativo de los rotavirus que a continuación se detallan, se han caracterizado principalmente en las células MA104. Esta línea celular, derivada de células epiteliales de riñón de mono, es una de las más susceptibles a la infección por rotavirus y ha sido ampliamente utilizada para caracterizar bioquímicamente a estos virus.

Interacciones iniciales del virus con su célula huésped: Adsorción, penetración y desnudamiento

La infección por rotavirus in vivo está restringida a las células de las puntas de las vellosidades del intestino delgado, lo que sugiere la existencia de receptores específicos del huésped (48) . La infección in vitro está también limitada a líneas celulares epiteliales de origen intestinal y renal (30). Aunque ha habido grandes avances en el conocimiento de la biología molecular y estructural de los rotavirus, es aún muy poco lo que se conoce acerca del (los) receptor(es) específico(s) para estos virus.

La unión de algunos rotavirus de origen animal a la célula huésped es dependiente de la presencia de ácido siálico (AS) en la superficie celular, y se ha demostrado que esta interacción es necesaria para que exista una infección eficiente tanto in vivo como in vitro (19, 66). Así, varios glicoconjugados que contienen AS han sido propuestos como posibles receptores para los rotavirus de origen animal. Tal es el caso de los gangliósidos GM3 en el intestino de cerdos recién nacidos, o GM1 en células LLC-MK2 (29). Por otro lado, se ha propuesto que las integrinas α2b1, α4b1 y αxb2 (23, 43) y más recientemente la integrina αvb3 (42), también pudiesen estar involucradas en las primeras interacciones de los rotavirus con su célula huésped. Las integrinas son una familia de proteínas heterodiméricas compuestas por una subunidad α y una subunidad β, que se encuentran en la membrana celular y que participan en las interacciones de la célula con la matriz extracelular y en las interacciones célula-célula. Las integrinas funcionan como señaladoras de una gran variedad de procesos celulares entre los que se encuentran la proliferación, migración y diferenciación celular, entre otros.

Los rotavirus son capaces de unirse a la superficie de una gran variedad de líneas celulares, sin embargo, sólo son capaces de infectar productivamente a un subgrupo de estas células (7). Por lo tanto, se ha sugerido que la primera interacción (dependiente de AS) es de naturaleza promiscua, mientras que la segunda interacción (independiente de AS) es más específica y podría determinar, al menos en algunos casos, si las células son susceptibles o no a la infección por rotavirus (67).

En estudios recientes se ha establecido que la unión de los rotavirus al receptor que contiene AS no es esencial, ya que se han aislado variantes cuya infectividad es independiente de la presencia de AS en la superficie celular (59, 66). La importancia secundaria del AS como receptor para los rotavirus también se ve reflejada en el hecho de que los rotavirus de origen humano se unen a las células permisivas a través de una molécula que no contiene AS (10), la cual no se ha identificado.

La caracterización comparativa de la unión de rotavirus de origen animal y de origen humano a la superficie de las células ha arrojado los siguientes datos: i) existen cuando menos dos dominios en la proteína VP4 de los rotavirus que interaccionan con la célula durante la infección viral, uno dependiente de AS, en VP8, y el otro independiente de AS, presente en VP5; ii) estas dos interacciones aparentemente son secuenciales de modo que un virus dependiente de AS requiere de esta primera interacción, para posteriormente poderse unir al segundo receptor que es independiente de AS; iii) los rotavirus de origen humano se unen a una tercera molécula, diferente de las dos primeras, que podría representar un paso común en la infección de los rotavirus humanos y animales (68). Quedan aún por determinar las moléculas celulares, su organización en la superficie de la célula, y la moléculas virales que participan en estas interacciones.

Posterior a la unión (Animación 3), el virus penetra hacia el interior de la célula huésped; sin embargo, el mecanismo por el cual este fenómeno se lleva a cabo es aún controversial. Se han utilizado estrategias bioquímicas y morfológicas para contestar esta pregunta; en estudios de microscopía electrónica se ha encontrado que los virus pueden entrar a célula por endocitocis (Animación 4); o por penetración directa de la membrana plasmática (38, 47, 60, 87, 93). Sin embargo, el hecho de que la infección viral no se vea inhibida por agentes lisosomotrópicos que incrementan el pH endosomal, o por drogas que afectan la endocitocis o el trafico de las vesículas endocíticas (6, 24, 38, 47, 60), ha sido tomado como evidencia en contra de que la vía de entrada de los rotavirus sea la de endocitocis clásica. Como alternativa se ha propuesto entonces, la penetración directa de la membrana plasmática (Animación 5), pero la evidencia que apoya este mecanismo es más bien indirecta. Actualmente varios grupos de investigación trabajan en esta área para definir de una manera precisa el mecanismo de entrada de estos virus.

Durante la penetración del virus a la célula, la partícula viral pierde las proteínas de la capa externa. Aunque el momento preciso y el mecanismo de este evento se desconoce, la remoción de la capa externa resulta en la activación de la transcriptasa viral (21, 93).

Después de la internalización del virus al citoplasma celular, el genoma viral es transcrito a partir de partículas que carecen de la capa externa o DLPs. El inicio de la síntesis de los mensajeros virales se lleva a cabo dentro de las DLPs, por medio de la acción concertada de la transcriptasa viral VP1 y la guanililtransferasa VP3 (Animación 6). Como se mencionó anteriormente, los ARNs mensajeros sintetizados sirven dos funciones: i) son traducidos para sintetizar las proteínas virales (Animación 7), y ii) son empleados como templados para sintetizar el ARN de doble cadena que constituirá el genoma de la progenie viral.

Una vez que se acumula una masa crítica de proteínas virales, en las células infectadas se forman grandes inclusiones citoplásmicas llamadas viroplasmas y se ha propuesto que es en éstas estructuras donde las partículas con dos capas (formadas por VP2 y VP6) se ensamblan y donde se lleva a cabo la replicación del ARN viral (Animación 8) (29).

La traducción de los ARNm de los rotavirus se efectúa tanto en polisomas libres como unidos al retículo endoplásmico. Un aspecto particular de la infección por rotavirus consiste en que, a medida que progresa la síntesis de las proteínas virales, se disminuye la síntesis de las proteínas celulares, la cual finalmente se abate casi en su totalidad.

Los procesos de encapsidación y replicación del genoma son eventos finamente coordinados ya que se llevan a cabo de manera concomitante. La encapsidación del genoma se lleva a cabo mediante la interacción de los segmentos de ARNm con las proteínas de la nucleocápside. Una vez que la nucleocápside se ha formado, los segmentos de ARNm son internalizados; se ha sugerido que la síntesis de la hebra complementaria de ARN podría llevarse a cabo durante el mismo proceso de internalización de los ARNm. Durante estos eventos participan algunas de las proteinas no estructurales del virus, que se encuentran asociadas a las partículas virales, que se conocen como intermediarios de replicación, como veremos más adelante. La adición de trímeros de la proteína VP6 a las nucleocápsides, lleva a la formación de una partícula mayor que tiene actividad de replicasa y de transcriptasa (40). Las proteínas no estructurales asociadas a esta partícula deben de perderse en algún evento posterior. La distribución intracelular de cada una de las proteínas involucradas en esta etapa de la morfogénesis del virus, sugiere que la formación de los intermediarios de replicación, así como la replicación del genoma, se lleva a cabo en los viroplasmas (1). Una vez que las DLPs han sido formadas y que se ha replicado completamente el genoma, estas partículas migran hacia el retículo endoplásmico donde el virus adquiere la capa externa de proteínas.

Dos de las proteínas del virus son sintetizadas en asociación con el retículo endoplásmico (RE) y están glicosiladas: La proteína estructural VP7, la cual forma la capa externa del virus, es sintetizada en el RE y se mantiene asociada a la membrana, orientada hacia el lumen del RE (13); la proteína no estructural NSP4 es también una proteína glicosilada residente del RE, la cual tiene al menos un dominio trasmembranal , el cual permite que 132 residuos carboxilo terminales estén orientados hacia el citoplasma. Este dominio citoplásmico funciona como receptor de las partículas con doble capa, interaccionando directamente con VP6. Además, NSP4 interacciona con la proteína VP4, la cual forma parte de la capa externa del virus. La interacción de NSP4 con VP6 y VP4 media la gemación de las partículas de doble capa hacia el interior del RE (4); durante esta gemación, las partículas adquieren una cubierta lipídica temporal que se pierde durante el viaje de las partículas hacia el interior del RE, y a la vez, mediante un mecanismo aún desconocido, se ensamblan las proteínas de la capa externa, lo que resulta en la formación de las partículas virales maduras con sus tres capas de proteína. Finalmente los virus maduros se liberan al medio mediante la lísis de la célula (Animación 9).

Durante la infección, todas las proteínas virales se acumulan en el viroplasma, a excepción de las dos glicoproteínas (VP7 y NSP4), que se localizan en el RE, y las proteínas no estructurales NSP1 y NSP3, que se localizan de una manera puntuada distribuidas en el citoplasma celular en asociación con el citoesqueleto (73). Además de las interacciones entre proteínas del citoesqueleto con las proteínas virales NSP1 y NSP3, se ha propuesto la existencia de otras interacciones. Se ha encontrado que la proteína no estructural NSP3 se une a los mensajeros virales reconociendo específicamente las cuatro ultimas bases (….GACC3') de la región conservada del extremo 3' de los ARNs (80, 81). Esta proteína, además de interaccionar con el citoesqueleto de la célula, interacciona específicamente con el factor celular eIF4GI que es un factor de iniciación de la traducción. En células eucariontes, este factor es responsable de la interacción de los ribosomas con el "CAP" de los ARNm e interacciona a su vez, con la proteína que une la región poli-(A)(PABP, poly-(A) binding protein) del extremo 3´ de los ARNm celulares. Se ha encontrado que la NSP3 puede desplazar selectivamente la unión de la PABP con el factor eIF4G1 in vitro e in vivo. Así, se ha propuesto que mediante la unión simultánea del extremo 3' de los ARNm virales y del factor eIF4G1, NSP3 favorece la síntesis de las proteínas virales e interfiere con la traducción de los ARNm celulares (78). Además, se ha propuesto que NSP3 le confiere estabilidad al ARNm viral, y participa junto con NSP1 en el proceso de traslocación del ARNm hacia el viroplasma, primer paso necesario para la morfogénesis del virus.

Por su parte, la proteína no estructural NSP1 interacciona con los 34 nucleótidos del extremo 5' del ARNm viral, y con el citoesqueleto, y se ha propuesto que pudiera bloquear la traducción de una fracción de los ARNm virales, conduciéndolos al viroplasma y secuestrándolos para servir como templados para la síntesis de la doble cadena del ARN. Se ha observado que los complejos NSP1-ARNm-NSP3 se asocian con las proteínas estructurales VP1 y VP3 . Dado que VP1 reconoce el extremo 3' (UGUGACC-3') del ARNm, región que se sobrepone con la reconocida por NSP3, y VP3 reconoce el extremo 5', se ha sugerido que NSP1 y NSP3 son desplazadas competitivamente por VP1 y VP3, y con este proceso quizá se concluye la traslocación de los ARNm al viroplasma, donde continua la morfogénesis de las partículas virales (73).

En la célula infectada, además de las proteínas estructurales mencionadas, algunas proteínas no estructurales están asociadas a las partículas subvirales que llevan a cabo la replicación del ARN. Asimismo, algunas de las proteínas no estructurales están asociadas a complejos moleculares que son precursores de estas partículas; en conjunto, estas partículas subvirales precursoras de la nucleocápside han sido denominadas partículas Intermediarias de Replicación (RI) (73). Se ha observado que existen diferentes tipos de RIs que pueden ser aisladas de acuerdo a su diferencia en tamaño. La composición de cada una parece obedecer una secuencia de eventos en los que algunas proteínas se adicionan y otras se sustraen de estos complejos a lo largo de la morfogénesis del virión (40). El primer tipo de partícula en formarse (denominada "precore RI"), está constituida por los ARNm virales, VP1 y VP3 y parece mantener a las proteínas no estructurales NSP1 y NSP3 asociadas. La subsecuente pérdida de NSP1 y NSP3 y la adición de la proteína VP2 constituye la partícula "core RI" , la cual tiene actividad de replicasa; a esta partícula están asociadas además las proteínas no estructurales NSP2 y NSP5 (73). La proteína NSP2 como multímero se une preferentemente al ARN de cadena sencilla, interacciona con VP1 y NSP5, y tiene una actividad de nucleósido trifosfatasa (NTPasa) a través de la cual se autofosforila in vitro e in vivo (49, 50, 95). Estas características han permitido suponer que NSP2 tiene un papel esencial en la replicación del ARN, y se ha propuesto que NSP2, por medio de su actividad de NTPasa, podría obtener la energía necesaria para funcionar como un motor molecular, facilitando el empaquetamiento de los ARNs mensajeros en las partículas subvirales, donde entonces, se llevarían a cabo su replicación (95) (Figura 7).

Patogénesis

Como ya hemos mencionado, los rotavirus infectan exclusivamente los enterocitos maduros localizados en las puntas de las vellosidades del intestino delgado. Se ha propuesto que la diarrea causada por estos virus es consecuencia de la destrucción de éstos. Sin embargo, recientemente se ha propuesto que, al menos en parte, la diarrea es causada por la proteína no estructural NSP4 que estimula la secreción transepitelial de cloro, por una vía dependiente de calcio, lo que desequilibra el balance iónico de la célula y provoca la salida de agua. Aparentemente, todo esto sucede previo a la destrucción del epitelio intestinal por la replicación viral. De hecho, se ha propuesto que la proteína NSP4 pudiese representar la primera enterotoxina viral descrita (34). También recientemente, se ha involucrado al sistema nervioso entérico como responsible de inducir una salida aumentada de fluido y electrolitos de las células de las criptas intestinales. Estos mecanismos de inducción de la diarrea podrían sugerir nuevas estrategias para prevenir o controlar la enfermedad causada por los rotavirus.

Además del papel que las proteínas de superficie juegan en la primera fase de la infección viral, éstas contienen determinantes antigénicos que representan blancos importantes del sistema inmune. Anticuerpos dirigidos contra cualquiera de las dos proteínas de superficie neutralizan al virus in vitro y son capaces de proteger pasivamente a ratones contra la infección por rotavirus (72). La infección oral con rotavirus estimula una inmunidad protectora que puede estar mediada por VP7 y/o VP4. Aunque se sabe poco de la inmunidad celular, ésta parece también tener un papel importante en la protección o cuando menos en la resolución de la infección, aunque no es claro cuál o cuáles de las proteínas virales la inducen.

Los esfuerzos que se han realizado en el campo para prevenir la infección, o al menos para disminuir los síntomas de la misma, han sido muchos y muy variados, desde la producción de proteínas virales recombinantes [individuales o como complejos proteicos (VLPs)] para ser utilizadas como vacunas inactivadas; la utilización de plásmidos de DNA que contienen algunos de los genes de rotavirus, para ser utilizados como vacunas de DNA; hasta las estrategias más clásicas o "jennerianas", en las que se han utilizado virus atenuados para inducir la respuesta inmune del huésped. Todos estos esfuerzos han tenido resultados variables (5), que serían tema de otro capítulo. Baste decir que la comunidad científica dedicada a estudiar a los rotavirus, tiene como una de sus prioridades el desarrollo de medidas profilácticas y/o terapéuticas, para disminuir la enorme tasa de morbilidad y mortalidad en la población infantil que es causada por estos agentes.

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