El género Azospirillum

Jesús Caballero-Mellado



Programa de Ecología Molecular y Microbiana, Centro de Investigación sobre Fijación de Nitrógeno, UNAM, Ap. P. 565-A, Cuernavaca, Mor., México.

Historia

Aún cuando Spirillum lipoferum fue descrito en 1925 por Beijerinck, esta bacteria estuvo olvidada por varias décadas. Son las observaciones de Peña-Cabriales y Döbereiner en 1973 (50) las que iniciarían la época moderna de esta bacteria. Estudios taxonómicos de S. lipoferum (88, 89) conducen a su reclasificación en un género nuevo, Azospirillum (166).

Actualmente son reconocidas seis especies en el género Azospirillum. Las dos primeras en ser descritas fueron A. lipoferum y A. brasilense (166), siendo éstas las mas ampliamente estudiadas. Posteriormente fueron descritas las especies A. amazonense (105), A. halopraeferans (141), A. irakense (85) y A. largomobile (26) siendo el nombre de esta especie corregido a A. largimobile (158). Pocos años antes ésta especie fue considerada como un sinónimo de la especie A. lipoferum (57). Recientemente, en honor de quien impulsara los estudios con este género bacteriano y descubriera otros diazótrofos, se ha propuesto la especie candidata A. doebereinerae (70).

Pocos años después del redescubrimiento de Azospirillum y hasta alrededor de 1993, este género fue el más estudiado entre las bacterias asociadas a plantas. La capacidad de Azospirillum para estimular el crecimiento de las plantas y de aumentar el rendimiento de los cereales promovió numerosos estudios sobre la ecología, fisiología y genética de esta bacteria. En la actualidad su uso comercial comienza a extenderse en diferentes países, incluído México.

Aislamiento

El aislamiento de las bacterias del género Azospirillum resulta en lo general muy simple, ya sea a partir de suelo rizosférico o de la superficie de las raíces (rizoplano) de numerosas plantas hospederas. También se le aisla del interior de las raíces o tallos de algunas plantas. El medio de cultivo usado por excelencia para el enriquecimiento de las especies de Azospirillum ha sido el NFb semigelificado "libre" de nitrógeno y con malato como fuente de carbono (52). No obstante, en este medio de cultivo son aisladas predominantemente cepas de las especies A. lipoferum y A. brasilense. El medio NFb con algunas modificaciones en su composición y pH permiten el aislamiento predominante de otras especies de Azospirillum (51). Estos medios son usados frecuentemente para evaluar la actividad reductora de acetileno, como indicativo de la fijación de nitrógeno. Tubos en los cuales se observa el crecimiento bacteriano en forma de sombrilla, la cual se transforma en una película blanca y densa abajo de la superficie del medio de cultivo, y vire del indicador azúl de bromotimol son considerados tentativamente como positivos para el aislamiento en cultivo puro de la bacteria.

El cultivo puro se logra en diferentes medios de laboratorio (126), siendo muy comunmente usado un medio adicionado del colorante rojo Congo (146), en el cual A. lipoferum y A. brasilense toman un color rojo escarlata que permite la diferenciación de otros géneros bacterianos. Aun cuando el medio BLCR fue diseñado para mejorar el aislamiento de cepas de Azospirillum brasilense (20), su uso no fue aceptado por haberse demostrado que no era apropiado para el estudio de poblaciones naturales de esta bacteria (73). Posteriormente se observó que la concentración de estreptomicina usada (200 mg/litro) en el medio BLRC era inhibitoria del crecimiento de un gran número de cepas (103).

Además de los medios y métodos descritos, tambien existen reportados algunos medios de cultivo y métodos para el crecimiento de Azospirillum en cultivo puro y en asociación con plantas, así como para su conservación (2, 126).

Identificación

El género Azospirillum pertenece a la subclase alfa de las proteobacterias (181), siendo A. lipoferum la especie tipo (166). Características útiles en la identificación rutinaria son la forma vibroide, el pleomorfismo y su movilidad en espiral (51). Las células contienen cantidades elevadas de poli-ß-hidroxibutirato (PHB), hasta 50% del peso seco celular (124), observándose al microscopio las células jóvenes con abundantes granulos refringentes. En cultivos semigelificados y gelificados con mas de 24 h de incubación se presentan frecuentemente células refringentes con forma ovoide y de paredes gruesas similares a quistes (96). Una de las características fenotípicas más ampliamente usada como criterio para el reconocimiento tentativo del género Azospirillum es el color rojo escarlata que toman las colonias (Fig. 1) al crecer en un medio adicionado del colorante rojo Congo (146). No obstante, en este medio pueden hallarse colonias mutantes de Azospirillum de color blanco debido a la incapacidad de producir polisacáridos no identificados (25).

Diversas pruebas bioquímicas y fisiológicas son utilizadas rutinariamente para el reconocimiento de las especies de Azospirillum. En la Tabla 1 se presentan algunas características fenotípicas que contribuyen a diferenciar las especies de Azospirillum. Adicionalmente, la diferenciación de especies del género Azospirillum se logra evaluando la capacidad de usar diversos aminoácidos y su efecto sobre la fijación de nitrógeno (68), recomendándose el uso de la histidina para la caracterización y aislamiento selectivo de la especie A. lipoferum.

Los patrones de proteínas de membrana (8, 48), así como los patrones de proteínas celulares (141), determinados mediante electroforesis en geles de poliacrilamida-dodecilsulfato (SDS-PAGE), permiten una clara diferenciación de las especies A. lipoferum, A. brasilense, A. amazonense y A. halopraeferens.

En forma complementaria para la identificación fenotípica de las especies de Azospirillum pueden ser usadas diversas técnicas inmunológicas. La aglutinación en tubo, técnicas de precipitación en capilar, inmunoelectroforesis (44, 46), inmunofluoresencia e inmunodifusión (44, 93) fueron métodos usados exitosamente en la identificación y numeración de Azospirillum spp. El uso de la técnica de ELISA (Enzyme-Linked Immnunosorbent Assay) permite la identificación y numeración específica de cepas de Azospirillum, como fue demostrado con la cepa Cd de A. brasilense (99) permitiendo evaluar la capacidad de colonización de esta cepa en plantas inoculadas.

La identificación genotípica específica al nivel de género y especies de Azospirillum se logra en forma reproducible mediante el uso de sondas basadas en secuencias de los genes 23S rRNA (86). Con los oligonucléotidos reportados se logra tanto la identificación específica del género Azospirillum como de las especies A. lipoferum, A. brasilense, A. amazonense, A. halopraeferens y A. irakense, mediante experimentos tipo "dot blot". Estas sondas también pueden ser usadas para la detección in situ de las especies de Azospirillum.

Alternativamente, la identificación genotípica rutinaria de las especies de Azospirillum, así como su detección, se logra fácilmente y en forma reproducible amplificando mediante el uso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) los genes 16S rDNA [p. ej. usando las secuencias de los oligonucléotidos 27f (5'-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG) y 1495r (5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA)] y cortando los productos amplificados con la enzima de restricción AluI (63, 66). Con esta estrategia se obtienen fragmentos de tamaños específicos para cada especie de Azospirillum, distinguibles fácilmente en geles de agarosa

Características genómicas

El genoma de cinco de las 6 especies de Azospirillum, excepto el de A. largimobile el cual no fue analizado, es constituído por varios megareplicones algunos de los cuales son aparentemente lineares (107). El tamaño global del genoma en las especies de Azospirillum varía de un mínimo de 4800-kb en A. irakense a practicamente el doble, 9600-kb en A. lipoferum. En A. brasilense y A. amazonenze el tamaño es alrededor de 7000-kb. El número de replicones varía entre cepas de A. brasilense, encontrándose comunmente 7-8 replicones (33, 107) (Fig. 2) e incluso hasta 10 en A. lipoferum (107). Sería de esperarse que uno de los replicones de gran tamaño correspondiera al cromosoma, pero interesantemente, en A. brasilense se mostró por primera vez que el genoma de esta especie está constituída por múltiples cromosomas (33), correspondiendo éstos a replicones de alrededor de 600-kb, 1000-kb y 1700-kb. La existencia de cromosomas múltiples en A. brasilense ha sido corroborada, pero se reporta la existencia de un cromosoma extra de alrededor de 2500-kb (107). En las otras especies de Azospirillum también se encontró que el genoma está constituído por varios cromosomas (107), confirmándose la hipotesis sugerida previamente (33) sobre la multiplicidad de cromosomas en el género Azospirillum. Asi, el género Azospirillum se suma al reducido grupo de bacterias [Agrobacterium tumefaciens (4), Brucella spp. (79), Burkholderia cepacia (36), Rhodobacter spheroides (163), Vibrio parahaemolyticus (180)] que presentan varios cromosomas en lugar de un solo cromosoma circular.

Aspectos de la genética de Azospirillum y de los genes que participan en la interacción con las raíces de las plantas, así como los involucrados en la fijación, asimilación y regulación de nitrógeno han sido revisados recientemente por Steenhoudt y Vanderleyden (161).

La presencia de plásmidos es común en A. lipoferum y A. brasilense, siendo ésta una de las primeras características genómicas reportadas para el género Azospirillum (Fig. 2). En general cada cepa muestra un perfil plasmídico único conformado por 1 a 6 plásmidos, con tamaños en el rango de 6- a 550-kb (59, 62, 136). Aun cuando se reportaron algunas discrepancias en el perfil de plásmidos, analizando incluso la misma cepa (p. ej. Sp 7), la presencia de un plásmido de 90-Mda (llamado p90; aprox. 135-kb) es común entre las cepas de A. brasilense. Debido a que el p90 no ha podido ser curado en A. brasilense, se considera que éste plásmido codifica funciones celulares esenciales (41, 131). Además de la presencia de plásmidos en cepas de Azospirillum, también fue reportada la presencia de minicromosomas (179), y aunque su designación fue hecha solamente sobre la base de su gran tamaño, 2775-kb aproximadamente, su presencia fue confirmada solo recientemente (33, 107).

Con excepción del p90, involucrado en la biosíntesis de ácido indol acético (84) y en la adherencia a las raíces (41, 111) no se conoce la función de los otros plásmidos en las especies de Azospirillum. No obstante, algunes genes como los nodPQ o exoB y exoC han sido identificados en el p90 mediante ensayos de hibridación o complementación genética (113, 175). Recientemente ha sido identificado el gen repA (origen de replicación del plásmido) en el p90 de A. brasilense (173). El mapa físico del p90 fue constuiído a partir del plásmido obtenido de la cepa tipo de Azospirillum brasilense Sp7 (131).

Distribución

Los azospirilla muestran una muy amplia distribución geográfica alrededor del mundo. Aún cuando son mas abundantes en las regiones tropicales, también se les encuentra en las regiones templadas, frías y desérticas (45, 52, 65, 169). En las regiones templadas del sur de Brasil, los Estados Unidos y Kenia la presencia de Azospirillum es menor al 10% en las muestras analizadas (52). El pH del suelo juega un papel importante en la presencia de las especies del género Azospirillum. Las especies de A. brasilense y A. lipoferum se encuentran en mayor abundancia en suelos con valores de pH cercanos a la neutralidad, aún cuando a pH abajo de 5 se les encuentra en forma esporadica y no lográndose su aislamiento de suelos con pH menor a 4.5 (52, 49, 120). Un estudio en el que se evaluaron 23 tipos de suelos con características diferentes mostró que algunos factores abióticos tales como porcentaje de arcilla, contenido de materia orgánica, capacidad de retención de agua y contenido de nitrógeno afectan positivamente la sobrevivencia de A. brasilense (24), en tanto que el tamaño de las partículas de arena y especialmente la alta concentración de carbonato de calcio afectan negativamente la sobrevivencia de esta especie en ausencia de plantas. No obstante, la sobrevivencia de A. brasilense en la rizosfera es independiente de la aridez del suelo.

Las bacterias del género Azospirillum han sido aisladas de la superficie de la raíz de una muy amplia variedad de plantas y de su rizosfera, incluyendo cereales como maíz, trigo, arroz, sorgo, avena (85, 91, 135, 94, 151, 156, 178), pastos forrajeros como Cynodon dactylon (34, 121), Poa pratensis, Festuca arundinacea (162), de diferentes especies de Pennisetum (87, 169) y Panicum (34, 103, 104, 169). Especies de Azospirillum fueron aisladas incluso del henequén [Agave fourcroydes (103)], y plantas cactáceas que incluyen diferentes especies de Opuntia y Stenocereus (109, 138). En algunos casos se logró confirmar el aislamiento de A. brasilense y A. amazonense de semillas de pastos esterilizadas superficialmente (162). Aun cuando no fueron identificados al nivel de especie, algunas cepas de Azospirillum fueron aisladas de esporocarpos de los hongos ectomicorrízicos Hebeloma crustuliniforme, Laccaria laccata and Rhizopogon vinicolor (100).

Ambiente rizosférico

Aparentemente, una bacteria del suelo deberá sobrevivir a las múltiples interacciones que se presentan con la compleja comunidad microbiana que habita el mismo microambiente, antes de que ocurra cualquier interacción con las raíces de la planta. En el inicio de una interacción con las raíces de la planta hospedera, el microorganismo específico deberá llegar a la superficie de las raíces, adherirse y multiplicarse para colonizarla. Si la bacteria tiene la capacidad de invadir los tejidos internos, se diseminará en el interior de la raíz e incluso en otros órganos de la planta.

La adaptación de Azospirillum al futuro ambiente rizosférico probablemente se inicia con la germinación de la semilla, la cual exuda infinidad de compuestos orgánicos que forman parte fundamental de la espermosfera. Posteriormente, la exudación de compuestos será a través de las raíces durante el desarrollo de la planta (43). Aun cuando las especies de Azospirillum difieren en su capacidad para utilizar diferentes compuestos como fuentes de carbono y nitrógeno, estas bacterias usan para su crecimiento unos pocos mono y disacáridos asi como alcoholes polihidroxilados, y principalmente diversos ácidos orgánicos tales como málico y succínico y algunos aminoácidos (68, 166). Para el uso de diferentes fuentes de carbono, tanto A. lipoferum como A. brasilense tienen todas las enzimas de la via de Embden-Meyerhof-Parnas y de la vía de Entner-Doudoroff (108, 177), así como todas las enzimas del ciclo de los ácidos tricarboxílicos (108). Tanto A. lipoferum como A. brasilense tienen la capacidad de crecer autotróficamente con H2 y CO2, proceso en el que participa la ribulosa-1,5-difosfato carboxilasa (106, 168). A pesar de que el uso de ácido poligalacturónico y pectina fue reportado en A. brasilense Sp7 (170, 171) y que se detectó actividad pectato liasa (167), existen evidencias contradictorias en cuanto al uso de polisacáridos por esta especie. A. brasilense puede metabolizar varios mono y disacáridos constituyentes de la pared celular de las raíces de Pennisetum americanum (118). Sin embargo, estos autores no pudieron confirmar que la cepa Sp7 fuera capaz de usar ácidos poligalacturónicos, o pectina, ni otros polisacáridos tales como xilanos, polipectatos y celulosa.

La riqueza en compuestos orgánicos en la espermosfera/rizosfera conduce a intensas actividades e interacciones microbianas. Algunos estudios indican que la quimiotaxis a los exudados de raíz es uno de los factores que influyen en la llegada de los microorganismos a la rizosfera (154). Tanto en A. lipoferum como en A. brasilense se demostró una fuerte actividad quimiotáctica hacia diversos azúcares, ácidos orgánicos y aminoácidos (13, 15, 71, 140), así como hacia compuestos aromáticos (102) y exudados radicales (5, 61, 71). La respuesta quimiotáctica a diferentes fuentes de carbono es variable dependiendo de la especie de Azospirillum e incluso es cepa-específica (140). También una respuesta hacia el oxígeno (aerotaxia) fue observada en A. brasilense (14, 15). Zonas de baja concentración en oxígeno fueron las preferidas por las células bacterianas para su crecimiento y multiplicación, siendo repelidas por altas concentraciones de oxígeno y condiciones anaeróbicas (14, 139). La aerotaxia parece ser especialmente importante bajo condiciones de fijación de nitrógeno, permitiéndole a las células de Azospirillum alcanzar concentraciones de oxígeno lo suficientemente bajas para que se exprese la actividad nitrogenasa. Se sugiere que tanto la respuesta quimio y aerotáctica son características que contribuyen en el proceso de colonización de las raíces de las plantas, ya que el consumo de oxígeno durante el crecimiento activo de las raíces enriquece el ambiente con sustratos orgánicos y genera gradientes de oxígeno al consumirse éste durante la respiración (112). No obstante, la colonización de la rizosfera y la superficie o el interior de las raíces será el resultado del enriquecimiento selectivo de los microorganismos mejor adaptados a estos ambientes. Por ejemplo, la capacidad para producir bacteriocinas por algunas cepas de A. brasilense y A. lipoferum (129, 130, 157, 165) podría representar ventajas competitivas sobre las cepas de estas especies o íntimamente relacionadas que sean sensibles a estas biomoléculas. Además, la capacidad de producir sideróforos (agentes quelantes del hierro) por algunas cepas de A. brasilense (9, 155, 165) (Fig. 3) pudiera ser de gran importancia durante la colonización del ambiente rizosférico y de la superficie de las raíces al ejercer efectos antagónicos contra otros miembros de la comunidad microbiana, incluyendo a microorganismos deletéreos o patógenos de las plantas (Fig. 4). Es concebible que en el ambiente rizosférico las especies de Azospirillum puedan ser antagonizadas. Alrededor de la tercera parte de más de 400 actinomicetos aislados de la rizosfera del centeno fueron reportadas como antagonistas de Azospirillum spp. y A. lipoferum (92). Esta actividad antagonista correlaciona con la alta sensibilidad de A. brasilense a los antibióticos estreptomicina, tetraciclina y cloranfenicol (103) producidos por actinomicetos del suelo, en comparación a la elevada resistencia a los antibióticos del tipo β-lactámicos producidos por hongos. La expresión constitutiva de la actividad β-lactamasa fue observada entre numerosas cepas de A. brasilense (103). Estos resultados sugieren que el antagonismo causado por hongos contra Azospirillum es limitado. También es concebible que se presenten efectos sinérgicos entre Azospirillum y otros miembros de la comunidad rizosférica. Por ejemplo, el filtrado de un cultivo de Phialophora radicicola, hongo usado como agente de biocontrol, promueve el crecimiento de A. lipoferum y A. brasilense (58). De manera similar, la interacción entre A. brasilense y Azotobacter chrococcum o Streptomyces mutabilis conduce a incrementos de sus respectivas poblaciones en la rizosfera de trigo (53).

Diversas condiciones tales como el envejecimiento celular y la presencia de metales pesados provocan que las células vibroides de Azospirillum cambien su morfología y tomen la forma de "quistes" (conocidos como formas C), conduciendo a la agregación celular y formando grumos visibles de gran tamaño (19). Aparentemente, residuos de arabinosa presentes en el exopolisacárido y en el polisacárido capsular estan involucrados en la agregación de A. brasilense (31). La agregación y la formación de quistes mejora la sobreviviencia de Azospirillum, situación en la que la acumulación de poli-β-hidroxibutirato (PHB) parece desempeñar una función importante al servir como almacen de carbono y energía (125). Además, diversas funciones fisiológicas son atribuidas al PHB, destacándose la mayor resistencia a la desecación (96, 147, 148), a la luz ultravioleta y al choque osmótico (164). Se ha sugerido que la formación de quistes pudiera desempeñar una función importante en la sobreviviencia de Azospirillum en el ambiente rizosférico, e.g., cuando los nutrientes son limitados, previo a la asociación con las raíces de la planta (164, 127). Recientemente, ha sido publicada una amplia revisión sobre las características de A. brasilense en relación con la agregación celular (29).

Interacción con la planta

Probablemente, una vez que las células de Azospirillum se han adaptado a las condiciones del ambiente rizosférico y han logrado llegar a la superficie de las raíces, debido a sus características quimio y aerotácticas, se iniciará el establecimiento de la asociación. Diferentes estudios han mostrado que A. brasilense tiene la capacidad para adherirse a las raíces de plantas gramíneas como el mijo (Pennsisetum purpureum) y Digitaria decumbens (171), trigo (77), maíz (61), así como a las raíces de plantas de otras familias que incluyen al algodón y tomate (98), e incluso a superficies inhertes como poliestireno y arena (22, 23, 98). La capacidad de Azospirillum para adherirse a las raíces, al menos a las de mijo, es significativamente mayor que la mostrada por otras bacterias de la comunidad rizosférica como Rhizobium, Azotobacter, Klebsiella o Pseudomonas, e incluso que E. coli (171). La asociación de Azospirillum con las raíces de las plantas se desarrolla en dos etapas completamente independientes (111). La primera consiste en una adsorción rápida, débil y reversible, la cual es dependiente de proteínas de la superficie bacteriana del tipo de las adhesinas en conjunto con la participación del flagelo polar (40, 111). La segunda fase consiste de un anclaje lento pero firme e irreversible que alcanza su máximo nivel 16 h después de la inoculación, el cual parece ser dependiente de un polisacárido extracelular de Azospirillum (111). Los resultados de un estudio reciente sugieren la posibilidad de que una proteína de la membrana externa de Azospirillum participe en el proceso de adherencia a las raíces de las plantas (31). El proceso de adherencia de Azospirillum a las raíces de las plantas ha sido revisado recientemente (29). En diversos casos se ha reportado la aparición de material fibrilar que contribuye al anclaje de Azospirillum a las raíces de diversas plantas (98, 171), describiéndose como esencial para el anclaje a las partículas de arena (23). Aún en la actualidad, la naturaleza del material fibrilar no ha sido elucidada (47, 161), aunque parece ser de origne bacteriano. Recientemente se ha publicado una revisión sobre la capacidad de Azospirillum para adherirse a superficies abióticas del suelo (18).

La inoculación de diversas plantas con Azospirillum ha mostrado que los principales sitios de colonización son las areas de elongación celular y las bases de los pelos radicales (98, 82). Sólo algunas células de Azospirillum llegan a adherirse a la cofia o a los pelos radicales (82). Sin embargo, fue observada la presencia de Azospirillum dentro del mucigel que se acumula en la cofia (171). La inoculación de raíces de trigo con una cepa de Azospirillum que expresa constitutivamente el gen reportero gusA mostró que en los primeros días de la asociación las células bacterianas colonizan específicamente los sitios de emergencia de las raíces laterales y las regiones de los pelos radicales, tanto de la raíz primaria como de las raíces secundarias y posteriormente la superficie de la raíz (172). En plantas de trigo fue observado que la inoculación de Azospirillum induce cambios en la morfología de los pelos radicales, siendo éstos cambios significativamente mayores que los causados por Rhizobium leguminosarum o Azotobacter chrococcum, los cuales son mínimos (77, 80). Además, fue observado que la inoculación con 105 a 106 células de Azospirillum causa tanto la elongación como el aumento de la superficie total de la raíz (Fig. 5), en tanto que la inoculación de 108 a 109 células causan la inhibición del desarrollo de ésta (82). Aparentemente, el incremento del tamaño del sistema radical se debe, al menos parcialmente, al aumento de la división celular y al intenso crecimiento de la zona de elongación de las raíces (97). Es de interés señalar que los sitios que coloniza Azospirillum lipoferum son diferentes, dependiendo de la variedad de la planta, al menos en el caso del arroz (116). La capacidad de Azospirillum para colonizar las raíces de las plantas es variable dependiendo de la cepa. Con el uso de microscopia confocal de rayos lasser y sondas de oligonucleótidos fluorescentes (6) y con el uso de anticuerpos monoclonales cepa-específicos (153) ha sido mostrado que algunas cepas de A. brasilense, incluyendo a la cepa tipo Sp7, se encuentran restringidas al ambiente rizosférico y son capaces de formar colonias solamente en la superficie de la raíz de plántulas de trigo, en tanto que otras cepas son encontradas frecuentemente en altas densidades en los espacios intercelulares de la raíz, así como en el interior de los pelos radicales. Resultados similares, usando otras metodologias, habian sido reportados con algunas de las mismas cepas de Azospirillum inoculadas en trigo creciendas en condiciones de campo (11).

Experimentos de inoculación

Considerando la capacidad de Azospirillum para asociarse con plantas de interés agrícola, así como su capacidad para fijar N2 en medios de cultivo, se diseñaron numerosos experimentos para evaluar el efecto de la inoculación sobre el crecimiento de las plantas. No existen reportes que indiquen efectos patogénicos en las plantas causadas por la inoculación de Azospirillum. El único reporte existente en esta dirección indica que ninguna de las especies de Azospirillum causa sintomas visibles de enfermedad sobre la raíz o las hojas de plantas de trigo, algodón o tomate (17). Con la inoculación de Azospirillum se observó frecuentemente un mayor desarrollo del sistema radical (Fig. 6) (123, 133, 135, 174) el cual se traduce en mayor superficie de absorción de nutrientes, así como en mayor desarrollo de la parte aérea de las plantas (Figs. 7 y 8) (7, 117, 123, 133, 135, 150). También fueron observados incrementos en el contenido de nitrógeno, fósforo, potasio y otros minerales en las plantas inoculadas (32, 101, 117, 133, 149, 160). Principalmente con A. brasilense y A. lipoferum se llevaron a cabo gran cantidad de experimentos en muchos países para evaluar su efecto sobre el rendimiento de los cultivos (3, 10, 11, 27, 32, 37, 56, 60, 80, 83, 110, 114, 119, 123, 134, 145, 149, 159, 176). Una amplia revisión sobre los resultados de los experimentos desarrollados entre los años 1974-1994 fue realizada por Okon y Labandera (128). Esta evaluación reveló que el éxito de la inoculación fue en el rango del 60 al 70% de los experimentos realizados en suelos y regiones climáticas diferentes (Fig. 9), con incrementos significativos, generalmente en el rango de 5 a 30%, en el rendimiento de los cultivos (Fig. 10). Sin embargo, cuando se evaluó el efecto de la inoculación en conjunto con la aplicación de niveles intermedios de fertilización con nitrógeno, fósforo y potasio, el éxito de los experimentos se incrementa hasta 90% (128). Frecuentemente se observó que la inoculación de los cultivos con Azospirillum permite reducir en 40-50% el nivel de los fertilizantes sin que exista disminución en el rendimiento de la cosecha. Recientemente fueron observados incrementos en la biomasa de pastizales naturales inoculados con A. brasilense aun bajo condiciones de crecimiento subóptimas (75).

Mecanismos de estimulación del crecimiento de las plantas

La capacidad de Azospirillum para estimular el crecimiento de las plantas ha sido demostrado en decenas de experimentos, tanto de campo como de invernadero. Varios son los mecanismos que se han sugerido como responsables del efecto estimulatorio observado en las plantas inoculadas.

En numerosos estudios de inoculación con Azospirillum, además del mejor crecimiento de las plantas, fueron observados incrementos en el contenido de nitrógeno total de las plantas inoculadas respecto a las testigo (10, 37, 81, 80, 117, 122, 133, 152, 160) y en la incorporación de 15N (90, 142, 143). No obstante, en la mayoría de estos estudios no fueron observadas diferencias significativas en el porciento de nitrógeno o en el contenido de proteína entre plantas inoculadas y no inoculadas, razón que contribuyó a desechar la idea de que la fijación biológica de nitrógeno fuera el mecanismo responsable de los efectos benéficos observados. Debido a que los efectos de la inoculación con Azospirillum sobre el crecimiento de la raíz y la parte aérea de las plantas son similares a los que se presentan cuando las plantas son tratadas con fitohormonas (144, 167) fue sugerido que estas sustancias podrían ser responsables del mejor crecimiento de las plantas, así como de los incrementos observados en el contenido de minerales y en el rendimiento de los cultivos (10, 27, 32, 80, 114, 119, 122, 135, 160)

Recientemente ha sido revisada la función de las fitohormonas en las asociaciones planta-microorganismo (72). Azospirillum tiene la capacidad de producir auxinas, citocininas y giberelinas en medios de cultivo (28, 55, 74, 109, 132, 144, 167). No obstante, el mecanismo analizado con mayor amplitud ha sido la producción de auxinas, especialmente la del ácido indol acético (AIA) (16, 67, 69, 78, 115, 182). El AIA producido por las bacterias puede modificar el contenido de fitohormonas de las plantas conduciendo a la estimulación del crecimiento de las mismas (12).

En cultivos de Azospirillum, además de AIA se han encontrado otros compuestos indólicos y metabolitos relacionados tales como el ácido indol pirúvico (38), indol láctico (39, 42), indol acetamida (12, 39, 69), indol acetaldehído (38), indol etanol e indol metanol (42), triptamina, antranilato y otros compuestos indólicos no identificados (69). En diferentes estudios se ha tratado de obtener mutantes incapaces de sintetizar AIA, sin embargo, en el mejor de los casos solamente se logró obtener mutantes hipoproductoras de este compuesto. Esto sugirió la existencia de más de una vía biosintética del AIA en Azospirillum (1, 69). Actualmente se conoce que Azospirillum puede sintetizar AIA a través de tres vías. En tanto que las vías del ácido indol pirúvico (38) y la del indol acetamida (12) son dependientes del triptofano, la tercera es una vía independiente de este aminoácido (137), desconociéndose el precursor del AIA. Resultados recientes permiten sugerir que la indol piruvato descarboxilasa es una enzima común tanto a la vía del indol pirúvico como a la vía no dependiente de triptofano (95).

A pesar de que existe la tendencia de atribuir a las fitohormonas, especialmente al AIA, los efectos benéficos de la inoculación con Azospirillum, también existe la propuesta de que tales beneficios son el resultado de diversos mecanismos (21, 101, 133, 135, 174). Se han sugerido otros mecanismos como responsables de los efectos estimulatorios causados por la inoculación de Azospirillum (183) y algunos de éstos han sido revisados por Bashan y Holguin (19).

Aplicación

Algunas compañias en diferentes países han registrado inoculantes de Azospirillum para maíz y otros cultivos (75, 128). Burdman y col. (30) refieren que en Sudafrica se lleva a cabo la producción de inoculantes a base de Azospirillum para 150,000 hectáreas de maíz y 12,000 de trigo. Algunas características de la producción de inoculantes a base de Azospirillum han sido discutidas (54, 76, 128).

Aun cuando el uso de Azospirillum como bioestimulante del crecimiento de las plantas no se ha generalizado mundialmente, en México la aplicación de ésta bacteria en diferentes cultivos ha revasado con mucho lo hecho en otros países. En el ciclo agrícola primavera-verano (PV) del año 1999 la Secretaría de Agricultura, a través de su Instituto Nacional de Investigaciones Forestales Agrícolas y Pecuarias (INIFAP) y de la Fundación Mexicana para la Investigación Agropecuaria y Forestal, A.C., en colaboración con el Centro de Investigación sobre Fijación de Nitrógeno-UNAM, llevó a cabo la inoculación de alrededor de 450,000 hectáreas de maíz y 150,000 hectáreas de sorgo, cebada y trigo, empleando cepas de Azospirillum seleccionadas por su capacidad para promover el crecimiento de las plantas e incrementar el rendimiento de los cultivos.

La evaluación del rendimiento de grano en alrededor de 675 hectáreas de los diversos cultivos, que comprendieron cerca de 170 sitios de México con características edáficas en regiones climáticas diferentes mostró el éxito de la inoculación en el rango de 62 a 95% de los casos analizados, con incrementos que fluctuaron en el rango de 6 a 98%. En la Tabla 2 se presenta un resumen de los resultados obtenidos en el ciclo agrícola PV-1999. El incremento promedio en la producción de los cultivos de maíz, trigo, cebada y sorgo bajo las diferentes condiciones evaluadas fue del 26%. Los resultados fueron dependientes de la variedad y cultivo, tipo de suelo, uso y nivel de fertilizantes (35). La mejor respuesta a la inoculación se presentó en suelos de tipo ligero (arenosos), con niveles intermedios de fertilización en el rango de 45-90 Kg N/ha, y con las variedades "criollas" de maíz. Considerando la cantidad de variedades, cultivos, suelos y condiciones climáticas evaluadas, los resultados de la inoculación con Azospirillum reflejan claramente la capacidad de la bacteria para promover el desarrollo de las plantas y el impacto positivo sobre el rendimiento de los cultivos de grano. El programa de "Biofertilización" se continuó durante el ciclo PV-2000, inoculándose alrededor de un millón y medio de hectáreas.

El temor o las precauciones expresadas en algunas revisiones sobre el tema, por cierto muy escasas, para extender el uso de Azospirillum a niveles comerciales debido a la "inconsistencia de la inoculación" tienen poco valor ante los resultados de producción obtenidos en decenas de experimentos, así como los obtenidos en miles de hectáreas con diferentes cultivos, variedades y condiciones edáficas y climáticas.

Aún en la actualidad hacen falta muchos estudios de investigación básica, tanto sobre la bacteria como en su interacción con la planta, para un mejor entendimiento de la asociación Azospirillum-planta. No obstante, en mi opinión, la aplicación de Azospirillum como bioestimulante que incrementa la producción de los cultivos deberia extenderse a todos aquéllos lugares donde la aplicación de fertilizantes es nula o escasa, como lamentablemente ocurre en no pocos países que tienen una agricultura subdesarrollada. En las regiones donde se practica una agricultura moderna, la inoculación con Azospirillum permitiría reducir las elevadas cantidades de fertilizantes que generalmente se aplican y con ello disminuir tanto el costo de producción como los problemas derivados de su uso, principalmente la contaminación, sin detrimento de la producción.

















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