Esperanza Martínez-Romero

Centro de Investigación sobre Fijación de Nitrógeno, UNAM. Apdo. postal 565-A. Cuernavaca, Mor. emartine@cifn.unam.mx

Introducción a los microorganismos

La vida en este planeta comenzó hace tal vez 4 mil millones de años con microorganismos y probablemente éstos serán los últimos sobrevivientes. Actualmente, la mayoría de los seres vivos son microorganismos(43)y también son los más diversos. Desconocemos la mayor parte de ellos.

Los microorganismos habitan hasta en ambientes extremos de temperatura, de pH y presión donde otros seres vivos no pueden vivir, como los hipertermófilos que crecen a 110°C(19)o los psicrófilos con temperaturas óptimas de cerca de 15°C. Otros como Deinococcus radiodurans son altamente resistentes a las radiaciones. Muchos microorganismos son habitantes naturales de otros seres vivos, y en general se localizan dentro de sus cavidades, sobre epitelios o en el lumen de órganos. Dentro de las plantas, se encuentran numerosas bacterias, incluyendo enterobacterias, que no les causan daño. Hay un millón de Escherichia coli por gramo de colon en nuestros intestinos y se estima que en el ser humano existen muchas y variadas células de microorganismos. En casos excepcionales los microorganismos se localizan intracelularmente (dentro de células) como Rhizobium (simbionte de plantas, no patógeno), Brucella, Rickettsia, micoplasmas (todos éstos patógenos). También dentro de algunos hongos de la micorriza, que se asocia a las raíces de las plantas, se encuentran bacterias intracelularmente, estas bacterias son viables, no cultivables y se consideran simbiontes(2).Nuestras mitocondrias algún día fueron bacterias que entraron a otras células cuando surgieron los eucariontes(25,64)y los cloroplastos de algunas plantas tuvieron su origen en cianobacterias.

Históricamente la designación de microbios se basó en el tamaño. Los más pequeños de todos los microbios son los virus. Mientras que las bacterias se pueden ver al microscopio óptico aunque ciertamente se ven mejor con el microscopio electrónico, los virus sólo se ven al microscopio electrónico y, si bien hay filtros que retienen a casi todas las bacterias, los virus pasan a través de ellos. Los virus no se pueden crecer en cajas petri con medio de cultivo, requieren otras células eucariontes o procariontes para infectarlas y proliferar dentro de ellas. Los virus de las bacterias se designan bacteriófagos. Los virus no tienen citoplasma, ni vías metabólicas y no son sensibles a los antibióticos. Es un error médico frecuente el administrar antibióticos en el caso de infecciones virales.

Ciertamente los patógenos han dado muy mala reputación a los microbios. Algunos microorganismos patógenos han matado más seres humanos que todas las guerras, y la mortalidad infantil elevada se ha debido en gran medida a enfermedades infecciosas. Los grandes azotes del pasado como la lepra, la peste o el tifo fueron causados por las bacterias Mycobacterium leprae, Yersinia pestis y Rickettsia typhi o prowasekii.

Fue en el afán de descubrir los agentes causantes de enfermedades que surgieron los cazadores de microbios en el siglo pasado(35);generaciones de microbiólogos se han inspirado en ellos. Los microbios siguen siendo noticia de primera plana, no sólo el virus del SIDA, el hantavirus, el Ebola, sino también las bacterias devoradoras de carne o las bacterias de la guerra microbiológica. Existe la sospecha que en la guerra del Golfo Pérsico en 1991 se utilizaron bacterias como Brucella. Un tipo de ezquizofrenia en humanos puede estar ligado al virus Borna transmitido por gatos. Algunos cánceres en humano son causados por bacterias como Helicobacter pylori o por virus como papillomavirus. Las infecciones por el virus papillomavirus son muy comunes en las mujeres en México y se correlacionan con el cáncer cérvico uterino.

Sin embargo, los patógenos no son la mayoría de los microorganismos existentes, los más son inocuos o benéficos y necesarios para los ciclos biogeoquímicos. Es a partir de microorganismos que se obtuvieron (y aun se obtienen) los antibióticos que revolucionaron la medicina moderna y el estudio de algunos modelos de entre ellos (vg. Escherichia coli) ha permitido descifrar los mecanismos de la vida. Algunos microorganismos benéficos no patógenos como Rhizobium y géneros relacionados se utilizan como biofertilizantes desde hace 105 años o como promotores del crecimiento de plantas; otras bacterias sirven como probióticos en la alimentación humana y animal, en biorremediación o en la producción de vitaminas o compuestos farmacéuticos.

La vitamina B12 sólo se sintetiza por microorganismos(14)y la fijación de nitrógeno, el proceso equivalente a la fotosíntesis en el ciclo del nitrógeno, es propiedad exclusiva de bacterias y de un grupo de arqueas(47).Se estima que si se suspendiera el proceso de la fijación biológica de nitrógeno todo el nitrógeno de la biósfera regresaría a la atmósfera. Las bacterias del suelo junto con hongos degradan y procesan la basura del planeta. Las polimerasas más ampliamente utilizadas en todos los laboratorios de biología y microbiología del mundo para sintetizar fragmentos específicos de ADN in vitro, a partir de cantidades minúsculas de este material, en la reacción de polimerasa en cadena conocida como PCR (por sus siglas en inglés), provienen de bacterias Thermus aquaticus (la polimerasa Taq) o de Pyroccocus woesei, la polimerasa PWO. Los microorganismos también han influido la vida del ser humano al ser responsables de la fermentación de bebidas alcohólicas y de diversos alimentos.

Las bacterias ayudan en la germinación de las semillas. Algunos compuestos útiles como el taxol (anticarcinógeno) que originalmente se presumía era de origen vegetal es producido por un hongo asociado íntimamente a la planta(71).Es más, se ha cuestionado si las llamadas "hormonas vegetales" del tipo citoquininas son realmente producto de la planta o de las bacterias asociadas(29).

Los microorganismos en el árbol universal de la vida

Los microorganismos se clasificaron por su aspecto al microscopio, por el tipo de colonias al crecer en medios de cultivo, por los nutrientes que utilizan o por su tinción con colorantes (reactivos como el Gram). Al surgir la bioquímica otros criterios, como la presencia o ausencia de vías biosintéticas, el tipo de ácidos grasos o de algunas proteínas, como ubiquinonas, permitieron reconocer grupos de bacterias(8).Sin embargo la identificación fenotípica mencionada no permite determinar con certeza el parentesco entre microorganismos, sólo entre las más cercanamente relacionadas.

La biología molecular ha revolucionado nuestra manera de ver a los microorganismos(21),ya desde 1965 Linus Pauling supuso que las moléculas contienen la historia evolutiva de los seres vivos(89).Así el análisis y comparación de secuencias de aminoácidos de proteínas o la comparación de las secuencias nucleotídicas de genes permiten no sólo identificar, sino clasificar y establecer las relaciones filogenéticas entre organismos o microorganismos(21,64,70).

La base del agrupamiento es lógica, organismos más cercanos tendrán secuencias más semejantes que los más lejanamente emparentados. Los catálogos de secuencias del gen del ARN de la subunidad pequeña del ribosoma (SSU rARN o 16S en bacterias) obtenidos por Woese y colaboradores son los más extensos que existen para un solo gen y abarcan todo tipo de organismos excepto virus, que obviamente carecen de estos genes por no poseer una maquinaria propia para la síntesis de proteínas; para hacer filogenias de los virus, se requieren las secuencias de genes virales. Cada gen ribosomal consta de aproximadamente 1500 bases o letras (A,T,C,G,) que pueden variar en cada posición del gen. Cada especie tiene una secuencia propia y característica de este gen. Si las secuencias de estos genes se alinean una tras otra se pueden identificar regiones conservadas y variables. En grupos cercanos de microorganismos se pueden reconocer firmas o regiones características. El análisis de la información de este gen u otros de un gran número de organismos sería imposible sin las computadoras y por ello diferentes algoritmos de agrupamiento se han desarrollado. Finalmente, el resultado de estos análisis permite generar árboles genealógicos o filogenéticos de todos los seres vivos y así con base en la secuencia del SSU rARN, se estableció el árbol de la vida en el que se reconocen tres dominios(86),Bacteria, Archeae y EukaryaFigura 1.Tabla 1

A las Archaeas en un principio se designó Arqueobacterias y a las bacterias se les llamó en un momento Eubacterias. Los dos primeros dominios están constituidos sólo por microorganismos y en el tercero existen algunos microorganismos pero también incluye a todos los seres pluricelulares como el hombre. En algunas Archaeas se han encontrado genes que se asemejan más a genes de eucaryotes que a genes de bacteria(6).

En bacterias, se identifican diferentes grupos, como las bacterias púrpuras o Proteobacterias (α,β, γ,δ), las Gram+, las cianobacterias, flavobacterium/bacteroides entre otras (53).Es de notar que la clasificación molecular coincide con la clasificación fenotípica en muchos casos pero no en todos.

El árbol universal de la vida (generado a partir de secuencias del ARN de la subunidad pequeña del ribosoma) ha sido criticado y su validez cuestionada(55).Esto ha sido porque los árboles filogenéticos generados en base a las secuencias de algunas proteínas no son similares a éste, con diferencias importantes(42).Sin embargo se ha analizado que en las proteínas existe un limitado número de sitios filogenéticamente significativos, pues son menos conservadas, tal vez por tener menor compromiso estructural excepto en los sitios activos(20).Esto significa que las letras en cada sitio en las proteínas varían ampliamente aún en grupos limitados, y por tanto, no existe un consenso para un grupo, que sea un buen marcador, para compararlo con el sitio equivalente en otro grupo de microorganismos. Por esto también se cuestionan las filogenias basadas en genes de proteínas. Por otro lado también se ha reconocido que puede existir recombinación en el gen del ARN ribosomal(17,46) y por tanto una distorsión de la tasa de evolución de este gen. También se ha observado que en algunas bacterias, en las que existen varias copias de los genes de RNA ribosomales, cada copia puede tener una secuencia diferente(79).

Cuando se secuenció el genoma completo de Thermotoga maritima(51)se encontró que parte de su genoma se asemejaba a ciertos microorganismos mientras que otra parte se asemejaba a otros pertenecientes a las Archaeas, que no se encuentran cercanos en el árbol de la vida. De este análisis surgió la pregunta si un gen (como el 16S ARNr) refleja todo un genoma para describir su historia evolutiva. En rescate del árbol universal de la vida surgió un reporte con un enfoque novedoso donde se comparan los proteomas inferidos de los genomas completamente secuenciados de 20 microorganismos(76).Con base en esta comparación se generó un árbol semejante al del ARN ribosomal. También los árboles filogenéticos obtenidos con el 50% de las proteínas de los genomas que se han secuenciado completamente o con el gene del ARN de la subunidad grande del ribosoma (23S en bacterias) son muy similares al árbol universal de la vida(41).El gen 23S ribosomal es un gen de mayor tamaño y por lo tanto con mayor información para establecer filogenias.

Las filogenias en protozoarios eucariontes o en hongos basadas en genes ribosomales han arrojado luz en cuanto a sus relaciones entre ellos y con otros organismosFigura 2.

En eucariontes, los organelos y sus genes tienen una historia evolutiva diferente del resto del genoma, por lo que son quimeras genéticas. En bacterias también es muy factible que diferentes partes del genoma tengan diferentes orígenes porque se hayan adquirido por transferencia lateral de genes(49).

Diversidad Microbiana

Dentro de algunas especies de bacterias, sus individuos difieren mucho unos de otros. Esta gran divergencia se ha explicado al considerar una gran antigüedad de estos linajes bacterianos(58),que se supone se han expandido acumulando diferencias. Además se ha sugerido que la extinción de clonas es menos frecuente que la generación de diversidad en bacterias(16).Se ha aludido también a la recombinación o el intercambio de información genética entre bacterias para explicar nuevos genotipos, más diversos. Dentro de algunas especies de bacterias, la distancia genética es tanta como la que se encuentra entre el hombre y la gallina.

Parece que en algunas bacterias, el genoma total de una especie no se encuentra en un solo individuo sino repartido en diferentes individuos o cepas. Esta información puede ser transferida de una bacteria a otra (ver más adelante) y las bacterias que comparten esta poza o reservorio genético se consideran que pertenecen a una misma genoespecie(32).

En otras especies se ha encontrado una diversidad limitada, por ejemplo en patógenos como Brucella abortus, Salmonella typhi, Legionella(45).La limitada diversidad de estas bacterias se ha atribuido a que surgieron más recientemente cuando aparecieron sus hospederos humanos o mamíferos.

Se estima que conocemos un número muy pequeño de las especies existentes de microorganismos(78) y que no será posible describir toda su diversidad. Sin embargo el número de especies estará en función de la definición de especie y de los límites que se establezcan entre especies(16).

Microoganismos no cultivables

El enfoque molecular ha permitido reconocer claramente la existencia de microorganismos "no cultivables"(30,40).De muestras ambientales, de diferentes suelos o del interior de plantas, se puede aislar ADN o en los casos en los que es posible, (como del océano) se recuperan bacterias de las que se extrae ADN sin pasar por un paso de cultivo. El ADN se usa como molde para la síntesis de los genes ribosomales existentes en la muestra. Esto se logra con una polimerasa y oligonucléotidos dirigidos a las regiones que se encuentran conservadas de los genes ribosomales en todas las bacterias (oligonucléotidos universales). Los fragmentos así sintetizados se clonan en vectores y la secuencia nucleotídica se determina. Esta metodología se ha optimizado y es posible gracias a que el protocolo de secuencia de nucleótidos se volvió simple. Ahora existen secuenciadores automáticos o se pueden pagar los servicios de secuencia a compañías especializadas. Las secuencias obtenidas de los genes del ARN ribosomal se comparan con las existentes en los bancos de datos, hay más de 5000 existentes de un número casi igual de especies bacterianas. Con este enfoque se ha revelado una diversidad que no se detecta con los métodos de microbiología tradicional(87).

Existen programas para verificar que las secuencias obtenidas de ADN ambientales no sean artefactos o quimeras, híbridos de genes de diferentes microorganismos(34).Si las secuencias no se parecen a la de ningún microorganismo existente en más de un 97% es posible que se trate de una bacteria nueva, tal vez no cultivada. La secuencia obtenida permite también identificar aquellos fragmentos de secuencia exclusivos de ella, esto es que no se encuentran en ninguna otra especie reportada. Fragmentos correspondientes a estas secuencias particulares se sintetizan en máquinas sintetizadoras de oligos, marcados con nucleótidos fluorescentes y se utilizan en las muestras originales (del ambiente) para visualizar por microscopía el tipo de bacteria que corresponde a los genes en cuestión, de preferencia en microscopios confocales. El visualizar a las bacterias es un paso hacia su aislamiento, pero el cultivar a muchas de las bacterias que han sido detectadas de este modo no siempre ha sido posible. En ocasiones se ha podido "resucitar" a bacterias como Vibrio de un estado no cultivable y este proceso se inhibe con nutrientes(85),sin embargo recientemente se ha cuestionado la viabilidad de algunos "no cultivables" y también la resucitación de Vibrio(4). Se logró crecer un Bacillus de unas esporas de tal vez 250 millones de años(81).El encontrar las condiciones para cultivar bacterias no cultivables es un reto para los microbiólogos(27).

Se ha acordado que a las bacterias "no cultivables" detectadas sólo por su secuencia de genes ribosomales se les designe "candidatos". Algunos ejemplos de estas son las bacterias de gran tamaño, magnetotácticas acuáticas (obtenidas de un lago en Alemania) que se pegan a imanes, designadas "Magnetobacterium bavaricum"(69)o candidatus "Liberobacter" un patógeno de cítricos(31)que es cercano a bacterias simbiontes benéficas del género Mesorhizobium que crecen con facilidad en el laboratorio. La posición filogenética de algunas de estas bacterias no cultivables se sitúa en ramas aisladas de otros microorganismos en el árbol universal.

No sólo se han detectado bacterias no cultivables sino también hongos, en particular los que forman endo-micorrizas asociadas a muchas plantas no se han podido crecer en medios de cultivo.

Existen diversas opiniones en torno al problema de no poder cultivar microorganismos de los que se ha documentado su existencia. Se ha pensado que éstos pueden requerir nutrientes particulares que sólo se encuentran en condiciones naturales. Algunos nutrientes tal vez sean proporcionados por microorganismos asociados. En la naturaleza, es común encontrar comunidades bacterianas en las que coexisten varias especies y géneros de bacterias. En estas comunidades pueden existir dependencias metabólicas complejas. El enfoque de microbiología tradicional tiene como primer paso el obtener cultivos puros de bacterias y tal vez esto ocasiona que sólo se cultive parte de los miembros de la comunidad. Otra posibilidad es que los medios típicos de crecimiento sean demasiado ricos, aún los medios mínimos tienen un exceso de carbono o de nitrógeno o de fósforo, e inhiban el crecimiento de microorganismos que en condiciones naturales, en general, viven precariamente. A este tipo de microorganismos se les ha designado oligótrofos, los microrganismos con comportamiento opuesto que pueden vivir en medio ricos, se designan copiótrofos.

En hongos y bacterias se han identificado oligótrofos(1,37,83);estos poseen sistemas de transporte de nutrientes de alta afinidad que les permiten tomarlos del medio en concentraciones muy bajas, prácticamente sin nutrientes. Así, estos microorganismos pueden crecer sobre vidrio, en agua, en plásticos, tomando las trazas de compuestos volátiles del ambiente. En Pseudomonas, Flavobacterium y en otros géneros se han identificado oligótrofos(83).Las bacterias fijadoras de nitrógeno pueden crecer en ausencia total de nitrógeno, porque convierten el nitrógeno gaseoso de la atmósfera en NH₄⁺. Una manera de identificar fijadores de nitrógeno es por su crecimiento en medios libres de tal elemento, sin embargo en estas condiciones también se aíslan falsos positivas que son bacterias oligótrofas que toman el amonio de la atmósfera pero no fijan nitrógeno. Se ha calculado que en los laboratorios y hospitales existen concentraciones de amonio suficientes para mantener el crecimiento de oligótrofos. Tal vez debieran considerarse oligótrofos en biorremediación, ya que un problema que se ha observado con algunas bacterias es que una vez que los contaminantes alcanzan concentraciones bajas, las bacterias ya no los toman ni los degradan. Los oligótrofos con alta afinidad tal vez pudieran participar para finalizar la limpieza

Intercambio de información genética entre organismos

Existen bacterias naturalmente competentes, que toman ADN del medio. El tomar ADN exógeno (transformación) puede tener como consecuencia una alta tasa de recombinación genética. Este tipo de comportamiento genético se ha designado panmítico que es el extremo opuesto del comportamiento clonal. Este último se refiere a aquellas bacterias que se mantienen como clonas o duplicados exactos de sus progenitores y que no adquieren o intercambian información genética con otras bacterias. Se piensa que la mayoría de las bacterias se comportan entre los dos extremos, lo que significa que intercambian en cierta medida información genética(48).

Por conjugación (sexo entre las bacterias) se transfieren fragmentos de cromosomas(67)o plásmidos entre microbios relacionados(52)Figura 3Animación 1.

Estos fragmentos, por recombinación homóloga con el ADN residente en el receptor, generan nuevas secuencias si ambas no son idénticas. Cuando se analizaron con cuidado las secuencias de un gen de varias cepas de E. coli se encontró que este gen parecía un mosaico de pequeños fragmentos, sugiriendo recombinación frecuente, sin embargo en general se considera E. coli como una bacteria clonal.

Las tasas de recombinación homóloga dependen de la similitud entre las secuencias y disminuyen considerablemente si los ADNs difieren más del 10%(82),sin embargo en cepas con mutaciones en genes de recombinación, puede ocurrir recombinación aun cuando el porcentaje de diferencia entre ADNs sea más alto (incluso hasta un 20%).

Plásmidos, fagos e islas genómicas, son mediadores de la transferencia lateral, se movilizan hasta géneros y especies distantemente relacionados(52).Los plásmidos se han considerado como elementos accesorios de las bacterias y esto es porque en general, si se eliminan los plásmidos, las bacterias pueden sobrevivir. Sin embargo, en otras bacterias, la pérdida de plásmidos (curación) conlleva pérdida de la viabilidad de la bacteria o de su capacidad para crecer(23).

Algunos plásmidos bacterianos se hicieron famosos porque acarrean y dispersan genes de resistencia a antibióticos, lo que ha ocurrido más frecuentemente con el uso extensivo de antibióticos. Estos plásmidos son conjugativos y se transfieren fácilmente entre bacterias. A estos plásmidos pueden brincar elementos transponibles del genoma llamados transposones que lleven resistencias adicionales y de esta manera se han generado plásmidos con resistencia a múltiples antibióticos(75).Estos genes de resistencia a antibióticos codifican para enzimas que degradan o inactivan a los antibióticos al modificarlos.

En años recientes se ha reconocido un nuevo mecanismo de resistencia a múltiples antibióticos(39).En las bacterias que poseen este mecanismo existen bombas o transportadores que eliminan al exterior de las bacterias los antibióticos y así éstos no ejercen sus efectos dentro de las bacterias. Los genes involucrados que codifican para estas bombas de extrusión en general se localizan en cromosoma, la excepción es una bomba en una bacteria benéfica de plantas (Rhizobium etli) que le confiere resistencia a los compuestos antimicrobianos (fitoalexinas) de las plantas y que está codificada en un plásmido(24) Figura 4.

Como no es factible reconocer un evento de transferencia genética en la naturaleza en el momento que ocurre, se deduce su existencia de diferentes maneras. Cuando un gen o un grupo de genes tienen un contenido de GC muy diferente al del resto del genoma se ha propuesto que este gen o genes provienen de otro microorganismo. Este también sería el caso, si por la secuencia de un gen se reconoce un parentesco con bacterias alejadas a la bacteria en la que se encuentra el gen. Esto se correlaciona con que filogenia del gen transferido es incongruente con las filogenias de otros marcadores como los genes ribosomales. La existencia de elementos asociados con transposición o vestigios de fagos también sugieren transferencia lateral.

De E. coli se han estudiado un vasto número de cepas de todo el mundo mediante la movilidad de sus enzimas en geles(62,68).En esta metodología el extracto celular de la bacteria se coloca en un extremo del gel y se hace migrar dentro del mismo mediante electricidad. Las proteínas más pequeñas migran más rápido y las variantes de cada enzima se distinguen como bandas diferentes al revelar su actividad con reactivos coloridos. Algunas enzimas tienen la misma movilidad, en todas las cepas de E. coli por lo que se designan enzimas monomórficas (una sola forma de enzima). La enzima más variable (polimórfica) fue la fosfogluconato deshidrogenasa que varía casi de cepa a cepa. El gen responsable que codifica para esta enzima fue clonado y secuenciado de varias cepas(3)y se encontró que este gene se encuentra contiguo a genes de lipopolisacáridos (LPS). En bacterias los genes de LPS son hipervariables. Esta gran variabilidad de los LPS y la del gen gnd que codifica para la fosfogluconato deshidrogenasa pueden explicarse por recombinación de genes de diferentes cepas. La variación en los genes de LPS permite a las bacterias evadir los anticuerpos del hospedero.

Los fagos en suelo se han propuesto como los mediadores principales de la transferencia de información genética entre bacterias y los virus se han propuesto como mediadores de información genética entre otros organismos(60).Sin embargo, a pesar de que existen fagos transductantes, la evidencia de que esta transferencia se de en la naturaleza no es contundente. En el laboratorio existe la transducción generalizada o específica. En el primer caso, en los fagos se encapsulan fragmentos del genoma de la bacteria sustituyendo al material genético del virus y éste al entrar a otra bacteria transfiere una parte del genoma de la bacteria que había infectado previamente. En el segundo caso los fagos que se insertan en sitios preferenciales del genoma al salir de la bacteria, si se escinden de manera imperfecta, se llevan parte del genoma bacteriano en el que se encontraban integrados. Estos fagos al entrar a otra bacteria le proveerán de material genético nuevo.

En Nueva Zelanda se introdujeron al suelo bacterias benéficas que forman nódulos fijadores de nitrógeno en las raíces de las plantas. En el suelo no existían bacterias capaces de formar nódulos. Al recuperar las cepas de los nódulos de las plantas se encontró un hallazgo interesante, las bacterias no eran las que se habían introducido, eran bacterias del suelo a las que se les había transferido la información genética para nodular y fijar nitrógeno de la bacteria introducida(72,73). La información genética transferida fue un fragmento del cromosoma que se designa "isla de simbiosis". En patógenos se han descrito "islas de patogenicidad" que también se transfieren entre bacterias. La isla de simbiosis se encuentra bordeada por un sitio de inserción de fago pero no se ha involucrado al fago en la transferencia.

En México, se domesticó el frijol y su bacteria asociada (Rhizobium etli), que seguramente coevolucionó con él. El frijol fue introducido a Europa después de la conquista de México y pensamos que en las semillas se llevó a la bacteria(56).Sin embargo sólo en ciertos sitios la bacteria permaneció y en otros creemos que el plásmido simbiótico se transfirió a las bacterias residentes. En estos casos el plásmido es muy semejante y el fondo genético es diferente.

En Rhizobium, la información para simbiosis se encuentra en plásmidos mientras que en las bacterias relacionadas como Mesorhizobium del caso anterior de Nueva Zelanda o Bradyrhizobium, esta información se localiza en el cromosoma. De Rhizobium se pueden transferir los plásmidos simbióticos a Agrobacterium convirtiendo así a un patógeno en simbionte(44).

Existe un caso extraordinario de transferencia de material genético de bacterias a plantas. Las bacterias son del género Agrobacterium recientemente reclasificados como género Rhizobium por el gran parentesco entre ambos(88).Las plantas receptoras son un gran número de dicotiledonas y el mecanismo es semejante al que usa la bacteria en conjugación con otra bacteria. Este proceso natural se ha aprovechado en la generación de plantas transgénicas y por tanto ha sido estudiado en gran detalle. Cuando la bacteria entra en contacto con la planta, productos de ésta última son señales que la bacteria reconoce y se activa la expresión de genes bacterianos de virulencia. Estos genes codifican para una especie de tubo (por el que se transfiere el ADN y proteínas asociadas) que conectará a la bacteria con la célula de la planta. Los genes de virulencia y el ADN que se transfiere se encuentran localizados en un plásmido de tumorogénesis Fig 5 Animación 2.

Un fragmento del ADN transferido conocido como T-DNA o R-DNA, dependiendo del tipo de cepa del que provenga, se integra en el genoma de las plantas en sitios no específicos. Este fragmento porta genes que se expresan en plantas y que codifican para enzimas que sintetizan fitohormonas (auxinas y citocininas) y derivados de aminoácidos (opinas). Las células vegetales empiezan a proliferar por el efecto de las hormonas y producen opinas que las bacterias en cuestión, pero no otras, pueden utilizar para su crecimiento. Este proceso culmina en la formación de tumores o proliferación de raíces, en las plantas. Si se eliminan los genes de fitohormonas y de opinas y en su lugar se colocan genes de interés, por ejemplo de resistencia a condiciones adversas o que produzcan bio-insecticidas u otros compuestos, éstos se integrarán por el mecanismo descrito al ADN de la planta y no ocasionarán la aparición de tumores sino efectos benéficos en las plantas, de este modo se construyen las plantas transgénicas.

El mismo proceso también puede ser utilizado de manera diferente en el estudio de plantas al provocar mutaciones, si el T-ADN o el R-ADN se integra en una secuencia de interés. Esto provocaría una mutante con un elemento insertado al que se le pudo integrar previamente un gen reportero (que produzca un color o una fluorescencia). El contar con un inserto (etiqueta conocida como Tag en inglés) permite la identificación del gen mutado y su análisis.

Se ha facilitado enormemente el estudio y existe un mayor conocimiento de las bacterias en las que se puede mutagenizar con fragmentos que transponen en el ADN, denominados transposones (semejante al caso anterior descritos para plantas). En bacterias, la mutagénesis al azar (en realidad no es tan al azar como se cree, pues hay algunos sitios preferenciales y otros refractarios) se realiza al transferir un plásmido suicida de una bacteria (e.g. E. coli) a otra en conjugación. El plásmido transferido, al no poder replicarse se pierde, pero el transposón se puede movilizar. Si el transposón se transfiere a cualquier parte del genoma de la bacteria receptora, se mantendrá la resistencia que codifica; si se inserta en un gen, provocará una mutación. Así se pueden seleccionar mutantes de la bacteria receptora en diferentes genes y construir bancos de mutantes.

Otra manera de generar mutantes en bacterias es introduciendo genes de resistencia o genes reporteros (conocidos como cassettes) en sitios específicos en secuencias de interés. De esta manera al abolir su función se puede tratar de entender para qué sirve ese gene.

Los genomas de los microbios

Se conocen las secuencias completas o casi completas de los genomas de más de 100 microorganismos entre los que destacan Mycobacterium tuberculosis, Mycoplasma genitalium, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Borrelia burgdorferi, Treponema pallidum, Rickettsia prowazekii, cianobacterias como Synechocystis sp. y Nostoc, la arquea Methanobacterium thermoautotrophicum y la levadura Saccharomyces cerevisiae.

Existen en curso proyectos genómicos en más de un centenar de microorganismos y este número parece estar en aumento. También se han reportado secuencias de muchos plásmidos y virus.

Se ha publicado la secuencia de una bacteria no cultivable, Buchnera sp. que es un endosimbionte obligado de áfidos(66).Buchnera es una bacteria relacionada con E. coli y con Haemophilus influenzae, pero con un genoma muy reducido que parecería un subconjunto del genoma de E. coli y se piensa que se trata de evolución de reducción del genoma. En Buchnera sólo hay dos genes para la síntesis de lipopolisacáridos; no hay genes para la síntesis de aminoácidos no esenciales, ni fosfolípidos; sólo hay genes para dos enzimas del ciclo de Krebs y no hay gen de recA. Esta capacidad biosintética tan reducida explica que no se pueda cultivar en medios de cultivo y que dependa de su hospedero para crecer y estar protegidos. En otros casos la determinación de la secuencia genómica de otros microorganismos no cultivables podría explicar por qué no se pueden cultivar.

En las anotaciones de los genomas se agrupan los genes por funciones, sin embargo un porcentaje muy alto de los genes potenciales (ORFs) no se parecen a nada reportado(7,12 y otros muchos), lo que indica que existe un gran campo de exploración en microbiología y el límite es la capacidad del investigador para imaginar funciones de los microorganismos codificadas por estos ORFs.

Los microorganismos como modelos en evolución experimental

Por sus tiempos de generación de algunas horas, los microorganismos tanto virus(28)como bacterias constituyen modelos con los que se pueden realizar experimentos de evolución experimental. Se ha utilizado Escherichia coli (18,38)y Myxococcus xanthus(80)y se piensa que la levadura Saccharomyces cereviceae, sería un buen modelo. En E. coli se han seguido hasta 20 000 generaciones (que equivalen a 500 000 años en generaciones de humanos, si se consideran 4 generaciones en 100 años) a partir de cultivos de una célula progenitora y se han seleccionado variantes más adaptadas que la cepa original a las condiciones de medios definidos. Los resultados más sobresalientes son que los linajes siguen caminos evolutivos diferentes; esto es, en cada cultivo ocurren diferentes mutaciones para adaptarse al mismo medio. Estos cambios ocurren después de pocas generaciones y se ven propiciados porque primero mutan genes "mutadores" lo que ocasiona mayor tasa de cambio(54).En M. xanthus se ha contraseleccionado la información genética para formar agregados y cuerpos fructíferos al crecer a estas bacterias continuamente en medios con agitación que favorecen a las células independientes(80).

Se ha considerado que no hay evolución sin transferencia lateral de información genética(13)y este factor no ha sido incluido en los experimentos reportados.

Agregados de microorganismos

En una colonia a partir de una sola bacteria se pueden distinguir sectores y diferentes estados metabólicos(65).En la naturaleza los microorganismos frecuentemente existen como biopelículas(50,59,61)y matas. Lo más notable es que las biopelículas son muy resistentes a antibióticos y que ocasionan graves problemas médicos. Dentro de las biopelículas existen flujos o canales de nutrientes, gradientes de oxígeno y estratos de bacterias. Los exopolisacáridos de las bacterias juegan un papel importante en la formación de las biopelículas. Es común que estos agregados no estén constituidos sólo por una especie microbiana. Obviamente los consorcios de diferentes especies bacterianas son más complejos. Métodos espectroquímicos, electroquímicos y microscopía confocal se están utilizando en el estudio de los biofilms(36,50).

Perspectivas de investigación en microbiología

Existen cazadores de microbios modernos que en ambientes exóticos, por ejemplo en un mercado en Colombia de una lagaña de un perro callejero, aíslan bacterias nuevas, no descritas. Si consideramos que se desconoce más del 95% de las bacterias, el describir bacterias nuevas parecería una actividad sin fin. ¿Cuáles son los límites de esta actividad? ¿Cuáles son las bacterias que el ser humano deberá conocer? ¿Hay microorganismos en extinción? ¿Se están gestando microbios patógenos en el ambiente con los cambios climáticos?

Se ha dicho que en un gramo de suelo existe una riqueza enorme de microorganismos(26,57)y tal vez algunos pudieran resolver problemas del ser humano. ¿Cómo identificar y cultivar este microorganismo? ¿Cómo preservar su existencia hasta que alguien lo analice? Desconocemos los efectos que la actividad humana tiene sobre los microorganismos. La devastación de selvas y bosques seguramente tienen efectos drásticos sobre los microbios. Las comunidades de bacterias son diferentes en un sitio cultivado y un sitio de la selva en el Amazonas(5).Los fertilizantes químicos alteran las poblaciones de bacterias fijadoras de nitrógeno(9)y el uso de antibióticos ha favorecido la proliferación de las resistentes.

En un enfoque muy diferente, compañías farmacéuticas y otros investigadores han emprendido la cacería de genes del ambiente(11).Aquí no importa el microorganismo del que provenga el gen. La meta es expresarlo en alguna bacteria conocida y obtener un producto novedoso que pueda probarse como fármaco, insecticida o promotor del crecimiento. Esta tarea parece titánica pero factible.

La secuenciación de genomas completos ha mostrado la existencia de enormes cantidades de genes potenciales (marcos abiertos de lectura, ORFs en inglés) cuya función se desconoce(7,12 y otros muchos). Una manera de avanzar hacia descifrar su función es eliminarla de las células por mutación. Podemos prever que el futuro de la investigación en microbiología requerirá de la generación de un enorme número de mutantes en muchos ORFs de diferentes especies

Por otro lado, existe una metodología nueva, aún en fase de estandarización, que permite reconocer todos los genes u ORFs que se expresan concertadamente en una condición ambiental, de nutrientes, o de temperatura. En su fase más sofisticada, un robot coloca en una laminilla de vidrio, de las utilizadas en los microscopios ópticos, gotas con cantidades minúsculas de los productos de PCR de cada uno de los genes u ORFs de un organismo. La placa se utiliza para hibridar con el ADN complementario (ADNc) sintetizado del ARN mensajero de bacterias de diferentes condiciones definidas. Estas condiciones pueden ser diferentes fases del crecimiento, fase exponencial versus fase estacionaria(33),medio rico versus medio mínimo(74)presencia o ausencia de diferentes nutrientes, o de otras células, diferente pH u osmolaridad. Los ADNc de cada condición se sintetizan con precursores fluorescentes de diferente color. Los colores en cada gen u ORF permiten reconocer si este gen se expresa en ambas condiciones en las que se creció la bacteria o sólo en una de ellas. En algunos casos el problema que se ha encontrado es la falta de reproductividad sobre todo en los genes en que su expresión se induce sólo unas cuantas veces arriba del control. A este análisis se le ha llamado microarreglos (microarrays en inglés). Los macroarreglos se pueden preparar manualmente en filtros con fragmentos de PCR de cada ORF o gen. Diferentes filtros se hibridan con cDNA marcado de cada condiciones. Todos los ORFs marcados son los que se encuentran sus ARN mensajeros en un momento dado. Se propone que estos enfoques, junto con otros como hibridación substractiva despliegue o (display) diferencial, ayudarán a definir funciones en genes desconocidos.

Otro enfoque ingenioso con perspectivas a futuro es de la "evolución in vitro". Aquí se mezclan genes de diferentes vías inclusive de vías metabólicas no relacionadas y también se pueden incluir genes mutados al azar o por recombinación. El objetivo es obtener síntesis de enzimas, proteínas, compuestos novedosos y esta estrategia ya se ha utilizado con éxito en la síntesis de nuevos carotenoides(63).Mediante manipulaciones genéticas más tradicionales de ingeniería genética se han logrado microorganismos sobreproductores de diferentes compuestos. Hay bacterias que producen cantidades prodigiosas de riboflavina (vitamina B2), hasta 5 g por litro(14)o se ha cambiado la especificidad de una enzima en otra, una lactato deshidrogenasa se convirtió en malato deshidrogenasa(84).

En microbiología, como en toda la biología, se han seleccionado modelos de estudio(22)y algunos de éstos se han analizado con gran profundidad. Esto se ve reflejado en el número de publicaciones por microorganismo(22) Figura 6.

Por ejemplo, E. coli es la bacteria en la que más investigación se hace y entre los hongos más estudiados se encuentra Saccharomyces. Sin embargo, una vez que se detecta un microorganismo de interés se puede avanzar muy rápido en su conocimiento basado en lo que se sabe en otros microorganismos. Esto ha sido el caso del virus del SIDA y en Helicobacter pylori. De este último por su importancia médica se secuenciaron dos cepas(15,77), se han secuenciado las islas de patogenicidad de muchas cepas y se han implementado experimentos de citoxicidad en diferentes líneas celulares de humano. En microbiología parecen válidos los enfoques extensivos que iluminan sobre la diversidad y abren nuevos horizontes y los intensivos sobre un microorganismo en particular. Es de notar que de un alto porcentaje de géneros bacterianos no se publica prácticamente ningún artículo.

La identificación de los organismos causantes de brotes infecciosos es posible gracias al uso de técnicas moleculares que permiten rastrear, a manera de detectives, la fuente de la contaminación. Así por ejemplo muy recientemente, las diarreas de unas pocas personas en ciudades alejadas en EE.UU. se atribuyeron a que el perejil que fue adquirido por algunos restaurantes llevaba Shigella sonnei por haber sido regado con agua contaminada. La rapidez en la detección evitó que otras personas enfermasen, se estima que si se hubiera podido realizar este tipo de rastreo en años anteriores, como en 1993, se hubieran podido prevenir algunos de los decesos causados por las E. coli enteropatógenas de las hamburguesas(10).

Los esfuerzos de la investigación en microbiología no han sido en vano, del conocimiento se han desprendido las herramientas para combatirlos y también para utilizarlos. ¡Qué no se podría lograr si supiéramos más!

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